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.2006年9月；17(9):3989-4001.
doi:10.1091/mbc.e06-03-0239。 Epub 2006年7月12日。

Fab1磷脂酰肌醇3-磷酸5-激酶控制内吞受体的转运但不沉默

托尔·埃里克·勒斯滕 1, 利纳·M·W·罗达尔, 克鲁帕·帕蒂尼, 卡米拉·恩格伦德, 克里斯托斯·萨马科夫利斯, 斯蒂芬·多夫, 安德烈亚斯·布雷奇, 哈拉尔德·斯坦马克
附属公司

Fab1磷脂酰肌醇3-磷酸5-激酶控制内吞受体的转运但不沉默

托尔·埃里克·勒斯滕等。 分子生物学细胞. 2006年9月.

摘要

内吞受体通过含有磷脂酰肌醇3-磷酸[PtdIns（3）P]的内体转运被认为会减弱其信号传导。在这里，我们证明PtdIns（3）P5-激酶Fab1/PIKfyve控制着细胞内吞受体的贩运，但不抑制其沉默。果蝇fab1突变体含有检测不到的磷脂酰肌醇3,5-二磷酸水平，细胞和器官尺寸显著增加，并在蛹期死亡。突变幼虫含有高度放大的多泡体和酸化无效的晚期内体。fab1突变细胞的克隆积累Wingless和Notch，类似于缺乏Hrs、Vps25和Tsg101的细胞，后者是泛素化膜蛋白内体分选机制的组成部分。然而，尽管hrs、vps25和tsg101突变细胞克隆积累泛素化货物，但fab1突变体并非如此。即使fab1突变体中的内吞受体运输受损，Notch、Wingless和Dpp信号也不受影响。我们的结论是，尽管Fab1对内胚体功能很重要，但它并不需要受体沉默。这与Fab1在内吞受体运输的晚期发挥作用的可能性相一致，即在信号终止时。

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数字

图1。
图1。
果蝇fab1结构、等位基因、表型和GFP-Atg18向胞内结构募集失败工厂1突变体。（A） 代表果蝇fab1cDNA（外显子为黑色，内含子为白色）和预测的蛋白质结构，包括N末端FYVE结构域、伴侣蛋白样结构域和C末端激酶结构域。带有相关数字的垂直条表示导致相应等位基因中提前终止密码子的点突变的位置，工厂18（Q1308停止），工厂131（L1321停止），以及工厂121（Q1521停止）。互补表显示工厂1小的等位基因，英国国防部(2R型)周30和更大的缺陷，英国国防部(2R型)氯化铅7亿这两者都揭示了制造厂1基因座。指出了各转基因组合的致死期。pa，法拉特成虫；wL3，游走L3幼虫；nd，未确定。（B）工厂1突变的法利特成虫和解剖的腿比处于类似发育阶段的对照动物大（蛹的腹侧和背侧视图用箭头表示身长）。（C和D）头部和眼睛显示头部主要由以下部分组成的动物的组织过度生长工厂1突变细胞（眼睛中的突变细胞缺乏红色色素；参见材料和方法). 小眼的平均大小是年的1.25倍工厂1突变眼（n=828眼小眼，8眼）比对照眼（n=952，8只眼）。（E–E〃）共聚焦图像，在L3幼虫的未固定眼盘中，GFP-Atg18的募集可以被观察到点状结构（箭头）、晚期内体和溶酶体（箭头），并用LysoTracker标记。（F–F〃）标记有20分钟TRD在固定眼成像盘中摄取的顶端内体共焦图像。请注意，TRD单独（星号，可能代表早期内体）或GFP-Atg18（箭头）可以看到结构。一些结构仅用GFP-Atg18标记（箭头）。（G–G〃和H–H〃）共聚焦图像概述，在共聚焦图像中，可以在对照组和工厂1变异眼盘。虽然可以清楚地看到GFP-Atg18集中在控制盘的亚细胞结构上，但在突变组织中没有发现这种亚细胞积累；在对照动物中，12.6±3.6%的GFP-Atg18结构也被标记为TRD（n=583个内体，5个眼影像盘），而在对照动物体内没有观察到GFP-Atg 18结构（0%）工厂1突变盘（n=303个内体，5个眼影像盘）。（一） 动画展示了通过PI 3-激酶（PI3K）将PtdIns转化为PtdIn（3）P以及随后转化为PddIns（3,5）P2由Fab1制作。FYVE结构域和酵母蛋白Atg18可以特异性地结合PtdIns（3）P或PtdIns（3,5）P2分别用作体内检测这些脂质的探针。条形图，1μ（C–E）和2μ（F–H）。基因型为工厂131/英国国防部(2R型)周30和+/英国国防部(2R型)周30（B） ，yw公司,ey-flp型,总经理LacZ/Y;FRT42D型,第页[迷你-w]，我(2)11氯/FRT42D型,工厂121,yw公司,ey-flp型,GMR-LacZ公司/Y（Y）;FRT42D型,第页[迷你-w]，我(2)11氯/+（C和D中的突变体和对照头），w个1118; tGFP-Atg18/+（E–G），以及工厂131/英国国防部(2R型)周30; tGFP-Atg18/+（H）。
图2。
图2。
Fab1亚细胞定位及其对溶酶体酸度的影响。（A和B）Fab1的点状亚细胞染色在来自L3游荡对照动物的分离Garland细胞中观察到，但来自L3的未观察到英国国防部(2R型)周30/英国国防部(2R型)氯化铅7亿缺少工厂1基因组区域。虚线表示细胞膜。（C和D）OGD内化于Garland细胞5 min，0（C）和40 min（D）后用Fab1进行免疫定位。40分钟后，当OGD主要标记晚期内体/溶酶体时，Fab1与OGD广泛重叠。（E–H）在翼想象盘上皮细胞的共焦切片中，早期的GFP-Rab5和晚期的GFP-Rab7也观察到广泛重叠，但Fab1似乎与GFP-2xFYVE和Hrs在分类内体/晚期内体时相似，而不是在同一区域。（一） LysoTracker发射强度是对细胞内晚期内体和溶酶体酸度的测量。图片显示的是在相同的共焦扫描设置下拍摄的突变动物的Garland细胞，与对照组相比，其平均酸度显著降低。（J和K）在翼想象盘上皮的光学Z切片中，与对照组相比，突变组织中TOTO-3标记的细胞核之间存在更多的空间和不规则组织。肌动蛋白聚集的顶端粘连连接的组织和含有大圆盘（Dlg）的基底部稍局限的隔膜连接似乎正常。棒材，5μm（A和B）、2μm（C和D）、1μm（E–H）、50μm（I）和5μm。基因型是w个1118（A、C、D、F、I和J），w个1118/+;ptc-镀锌4/UAS-GFP-Rab5型（E） ，w个1118/+;ptc-镀锌4/UAS-myc-GFP-dbFYVE公司（G） ，w个1118/+;ptc-镀锌4/UAS-GFP-Rab7型（H） 、和工厂131/英国国防部(2R型)周30（I和K）。
图3。
图3。
年前溶酶体隔间内改变的液相运输和货物堆积工厂1突变体。（A和B）OGD在摄取5分钟后积聚在小的外周小泡中，并在40分钟的追逐期后到达晚期内胚体/溶酶体室（箭头所示）。（C和D）输入工厂1相比之下，突变体OGD在追逐后未能到达酸化的隔室（注意，红色通道的探测器增益增加，以允许在制造厂131/英国国防部(2R型)周30单元格）。（E–J）对照电子显微照片（E–G）和工厂1（H–J）花环细胞。（E和H）低倍镜显示对照细胞中正常大小的内体，以及fab1细胞中大大放大的内体（两张显微照片中的箭头）。为了进一步描述内吞途径，我们用BSA-Gold（所有显微照片中的箭头）培养细胞，持续培养40分钟。（F和G）在对照细胞中，我们在内胚体结构和溶酶体室中观察到BSA-gold（F和G放大插图中的箭头）。（I） 在制造厂1突变体，BSA-gold定位于显著增大的内体，在致密溶酶体结构中未观察到。请注意，仅描述了内体的一部分。（J） I中方框区域的放大图显示了与内体致密物质相关的金颗粒。n、 细胞核；e、 内体；和l，溶酶体。棒材，2μm（A–D）、1μm（E和H）、100 nm（F）和200 nm（G和I）。基因型为w个1118（A、B和E–G）和工厂131/英国国防部(2R型)周30（C、D和H–J）。
图4。
图4。
受体和配体在细胞内的自主积累工厂1突变体。（A–C和I）Wg表达于翼囊和凹槽中的细胞中央条纹中，并在邻近细胞中被吸收，在距源20μm的胞内小泡中可以观察到（I，50个共焦叠加的投影，相距1μm）。（D、E、G、H和J）英寸工厂1突变的翼盘，可以在扩大的细胞内小泡中看到Wg积聚，无论是在翼囊中还是在距源40μm处可见的凹槽中（J，像I中的投影）。这种堆积物在全长表达后被特意保存在翼囊中工厂1在翼袋下面节点-Gal4对照组（G和G′），而不是在notum（H）。（F） Wg的细胞自主积累见于工厂1克隆（虚线），标记为不存在GFP，位于Wg生产源之外（插图中显示了概述）。（K） 细胞内小泡中也可见类似的Notch积聚工厂1形态发生沟（箭头）后面眼盘的突变细胞。（五十） Notch配体Delta（Dl）在工厂1突变卵泡细胞。（M和N）泛素化蛋白在高分辨率分光计但不在工厂1翼盘中的突变克隆（用虚线勾勒）。棒材，10μm（A、B、D、E、G和H）和50μm（I和J）。基因型为w个1118（A–C和I），工厂131/英国国防部(2R型)周30（D、E和J），工厂131,nub-Gal4合金/英国国防部(2R型)周30;第页[迷你-w,UAS工厂1]/+（G和H），yw公司,热休克蛋白70-flp/+;FRT42D型,第页[迷你-w,ubi-GFP公司]/FRT42D型,工厂121（F、K、L和N），以及yw公司,热休克蛋白70-flp/+；FRT40A型,第页[迷你-w,ubi-GFP公司]/FRT40A型,高分辨率分光计28天（M） ●●●●。
图5。
图5。
受体和配体在扩大的晚期内胚体结构中积聚工厂1突变体。在对照组和工厂1变异的翼盘。（A–D）单个共聚焦切片和单独的扩大通道显示Wg在扩大的Hrs-阳性早期内体和Rab7-阳性MVB的内腔中的定位工厂1变异的翼盘。（E和F）Wg在对照细胞和突变细胞中与2xFYVE共定位（箭头）。在突变的椎间盘（箭头）中，一个额外的大Wg囊泡池非常突出。（G和H）突变组织中最大的Wg阳性结构（2-5μm）与人Lamp1-HRP融合蛋白的管腔HRP部分共定位，而对照组织中Wg和HRP-Lamp1之间几乎没有重叠。（一） 内源性Lamp1在含有Lamp1阳性内体的大Wg的限制膜上的点状结构中被检测到。（J） 与Wg一样，含有2至5μm大小缺口（N）的大结构中含有Lamp1，该结构似乎是工厂1突变克隆（−/−），而杂合对照细胞（+/-）几乎没有重叠。（K） 大型含缺口结构与TRD共定位。（L和M）在dpp-Gal4控制下，对表达HRP-Wg的翼盘中的Wg和HRP表位进行免疫检测（左侧概述，右侧有重叠和分离通道的放大），显示Wg和HRP在大结构中广泛共定位，在突变组织中，许多细胞直径远离来源。在对照组织中，HRP主要在小结构中单独检测。基因型为w个1118（A） ，工厂131/英国国防部(2R型)周30（B、I和K），w个1118;pUAS-GFP-Rab7型;dpp-Gal4型/+（C），工厂131/英国国防部(2R型)周30,pUAS-GFP-Rab7型;dpp-镀锌4/+（D），w个1118;pUAS-myc-GFP-dbFYVE公司/+；dpp-Gal4型/+（E） ，工厂131/英国国防部(2R型)周30,无人机-无人机-myc-GFP-dbFYVE;dpp-镀锌4/+（F），w个1118,dpp-镀锌4/UAS-hrp-灯1（G） ，w个1118/+;工厂131/英国国防部(2R型)周30;dpp-镀锌4/UAS-hrp-灯1（H） ，yw公司,热休克蛋白70-flp/+;FRT42D型,第页[迷你-w,ubi-GFP公司]/FRT42D型,工厂121（J） ，w个1118/+；dpp-镀锌4/无人机hrp-Wg（五十） 、和w个1118/+;工厂131/英国国防部(2R型)周30;dpp-镀锌4/无人机hrp Wg（M） 。棒材，5μm（A–H和K）、2μm（I和J）和1μm（L和m）。
图6。
图6。
贩运和分类HRP-Lamp1和HRP-Wg工厂1突变体。电子显微镜显示在dpp-Gal4控制下表达的酶转化HRP-Lamp1和HRP-Wg在翼盘上皮内的定位。（A和B）HRP-Lamp1位于控制翼盘中的典型MVB中（A中的箭头）。（C和D）输入工厂1突变圆盘，HRP-Lamp1积聚在形态可变的较大囊泡（C中的箭头）中。一些具有大小不等的不规则腔内小泡（D中的箭头），而另一些似乎具有更规则的多泡形态（D中箭头）。（E和F）野生型（E）和工厂1突变细胞（F）在冷冻切片制备的组织中变得更加明显。（G和H）在控制翼盘中，HRP-Wg主要在200至600 nm直径范围内的MVB中观察到（我们未公布的数据）。（I和J）英寸工厂1突变圆盘，HRP-Wg积聚在更大的囊泡内，表明配体从限制膜上发生了分选。基因型为dpp-镀锌4/UAS-hrp-灯1（A和B），w个1118/+;工厂131/英国国防部(2R型)第30页;dpp-镀锌4/UAS-hrp-灯1（C和D），w个1118（E） ，工厂131/英国国防部(2R型)周30（F） ，w个1118;dpp-Gal4型/无人机hrp Wg（G和H），以及w个1118/+;工厂131/英国国防部(2R型)周30;dpp-镀锌4/无人机hrp-Wg（I和J）。
图7。
图7。
Wg靶基因激活工厂1和高分辨率分光计突变细胞。在花叶病或突变动物中评估Wg信号在不同阈值（总结在I中）激活的靶基因表达。（A–H和K）在工厂1突变细胞与对照细胞比较。（J） 与之前报道的一样（皮迪尼等。, 2005),高分辨率分光计突变细胞显示正常的Dll水平。基因型为w个1118（A–D），工厂18/英国国防部(2R型)第30页（E–H），hsflp/+；FRT40A、Ubi-GFP/FRT40A、，高分辨率分光计28天（J） 和hsflp/+；FRT42D、Ubi-GFP/FRT42D、，工厂131（K） ●●●●。
图8。
图8。
Dpp和Notch靶基因激活工厂1突变细胞。（A和B）野生型卵泡细胞中Dpp激活的核磷酸化pMAD（箭头，光学Z截面；B）的两个细胞行的范围。（C和D）pMAD激活范围在工厂1突变卵室（箭头，光学Z截面；D）。（E和F）对于剥落（Sal）以梯度激活，以响应翼囊中的Dpp信号（E中的方框在F中放大）。（G） Notch靶点Eyg在工厂1眼盘中的突变克隆。基因型为w个1118（A和B），hsflp/+；FRT42D、Ubi-GFP/FRT42D、，工厂131（C–F）和hsflp/+；FRT42D、Ubi-GFP/FRT42D、，工厂121（G） ●●●●。
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