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.2006年9月；17（9）：4063-8。
doi:10.1091/mbc.e06-03-0200。 Epub 2006年7月5日。

酵母Sec61p的插入结构域对有效的蛋白质移位很重要，但对细胞活力不是必需的

蒂娜·朱恩 1, 托尔斯滕·施威德, Veit Goder公司, 马丁·施皮斯
附属公司

酵母Sec61p的插入结构域对有效的蛋白质移位很重要，但对细胞活力不是必需的

蒂娜·朱恩等。 分子生物学细胞. 2006年9月.

摘要

Sec61/SecY转座子介导蛋白质跨膜转运和膜蛋白整合到脂质双层。转座子的结构显示，内腔侧有一个堵塞孔。它被认为是重要的门控蛋白质传导通道和维持其未被占用状态的通透性屏障。在这里，我们分析了在酵母中引入插入域的不稳定点突变或其部分或完全缺失的影响。出乎意料的是，即使删除了整个插入域，细胞仍能存活，没有生长表型。它们对诊断信号锚定蛋白的信号序列定向有影响，在共翻译中有轻微缺陷，在翻译后易位中有显著缺陷。突变蛋白的稳定状态水平降低，当与野生型Sec61p共表达时，缺乏塞子的突变体对复杂伴侣的竞争能力较差。结果表明，塞子对封闭酵母中的易位孔不太重要，但在易位子形成期间，塞子在稳定Sec61p中发挥了作用。

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图1。
图1。
酵母Sec61复合物的插入域。酵母Sec61复合物结构的立体表示，模拟了M（M）.詹纳什基SecYEβtranslocon（范登伯格等.，2004）所示为胞质面朝上。该模型显示为带有插入结构域（残基52–74）的立体主干，该插入结构域被Δ插入突变体中的甘氨酸取代，显示为充满空间的轮廓。Sbh1p以红色显示，Sss1p以橙色显示，Sec61p从N到C末端以蓝色到黄色显示。模型中不存在Sec61p的P200-E212和D227-N240段。
图2。
图2。
插入域中的突变没有生长缺陷。（A） 测量液体培养物的生长曲线Δssh1表达野生型Sec61p或所指示的插入突变的细胞。（B）Δssh1将表达野生型Sec61p的细胞或缺乏整个插入域（Δplug）或TM2（ΔTM2）的突变体细胞以系列稀释液接种到YPDA平板上，并在15或39°C下培养3d，或接种到含有0.3μg/ml衣霉素的YPDA平板，并在30°C下孵育3d。
图3。
图3。
所有插入突变对模型蛋白的拓扑结构具有相同的影响。（A） 用于分析拓扑变化的诊断蛋白底物以深灰色（Leu16)或黑色（去唾液酸糖蛋白受体H1），侧翼电荷为+和−，糖基化位点为黑点。根据Hartmann的说法，它们的名称表示信号前N端亲水序列的长度、括号中的疏水信号核心（H1或Leu16）以及电荷差Δ（C–N）等（1989）。（B） 这三种底物表达于Δssh1带有野生型、Δplug或ΔTM2 Sec61p、脉冲标记5分钟的电池[35S] 蛋氨酸，并通过免疫沉淀、SDS-gel电泳和放射自显影术进行分析。与含有零、一、二或三个聚糖的多肽相对应的形式用箭头表示。破折号表示37-kDa分子量标准的位置。（C） 所示Sec61p突变体对模型蛋白取向的影响通过荧光成像仪定量标记实验（如B所示）来确定。二倍和三倍糖基化物种共同代表具有易位C末端的多肽。它们占总数的比例（在60[H1]（+1）的情况下，不包括未糖基化的非整合产品）表示为与野生型值的偏差（以百分点为单位）。显示了单次测定（无误差条）或两到六次测量（SD平均值）的结果。带有野生型Sec61p的C-末端易位产物的绝对分数，[Leu16]（−3）为29.1%，40[Leu16（+5）为46.3%，60[H1]（+1）为60.2%。
图4。
图4。
Sec61p突变的共翻译和翻译后整合缺陷。在Δ中分析了DPAPB作为共翻译底物和CPY作为Sec61转译子翻译后底物的整合ssh1型背景脉冲标记5分钟[35S] 蛋氨酸、免疫沉淀、凝胶电泳和放射自显影术（A）。不同的产物对应于DPAPB的糖基化（g）和非糖基化（u）形式，以及CPY的糖基化第一前体（p1）和非糖基化前体（pp）。作为对照，在用内糖苷酶H（EndoH）脱糖基后，分析来自表达野生型Sec61p（wt）的细胞的标记蛋白。未糖基化形式对应于未整合的多肽，并被量化为B中总多肽的一部分。在C中，通过免疫印迹分析测定成熟CPY（m）的稳态水平。在通道2-4中分析等量的细胞裂解物。
图5。
图5。
插头缺失会损害转座子水平。（A） 通过等量蛋白质的免疫印迹分析测定野生型和突变型Sec61p的稳定量。（B） 通过在存在翻译抑制剂环己酰亚胺的情况下培养0、1、2、4或8小时的细胞的免疫印迹分析，估计野生型Sec61p和Δplug和ΔTM2突变体的半衰期。显示了Δ插头和ΔTM2与野生型的类似启动信号。（C） Sec61p水平通过免疫印迹分析确定，细胞同时表达来自染色体的野生型Sec61p第61节基因和Δplug或ΔTM2突变体欧洲标准化委员会质粒（分别为wt/Δplug和wt/△TM2）。细胞不含额外的质粒（−），或含有第1页(+β),SSS1型（+γ），或两者（+β+γ）及其天然启动子，或2μ质粒第1页或SSS1型带有GPD启动子（分别为+β*和+γ*）。或者，用0.3μg/ml衣霉素（+Tun）培养细胞3小时，以诱导未折叠蛋白反应。作为对照，分析仅表达野生型Sec61p（泳道1、9、11、13和15）或Δplug或ΔTM2突变体（分别为泳道2和16）的细胞。第9-14道来自相同的免疫印迹。
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