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.2006年7月；26(14):5421-35.
doi:10.1128/MCB.02437-05。

肿瘤坏死因子-α转化酶（TACE）对前脂肪细胞因子1（Pref-1）的外周体脱落和脂肪细胞分化的抑制

王玉辉 1, 南喜树
附属公司

肿瘤坏死因子-α转化酶（TACE）对前脂肪细胞因子1（Pref-1）的外周体脱落及脂肪细胞分化的抑制

王玉辉等。 分子细胞生物学. 2006年7月.

摘要

前脂肪细胞因子1（Pref-1）是一种表皮生长因子重复序列，含有前脂肪细胞中发现的跨膜蛋白，在体内外抑制脂肪细胞分化。在这里，我们检测了Pref-1A的膜形式的处理过程，以释放抑制脂肪细胞分化的50-kDa可溶性形式。佛波醇12-肉豆蔻酸13-乙酸酯以剂量和时间依赖性的方式显著增强Pref-1的外结构域裂解。宽型金属蛋白酶抑制剂GM6001抑制了基础和刺激的切割，这表明膜Pref-1A的切割依赖于金属蛋白酶。接下来，我们发现可溶性Pref-1A的释放被TAPI-0和金属蛋白酶组织抑制剂TIMP-3抑制，TIMP-3可以抑制肿瘤坏死因子-α转换酶（TACE），但不被TIMP-1或TIMP-2抑制。另一方面，TACE的过度表达增加了Pref-1的分裂，以产生50-kDa的可溶性形式。此外，在TACE突变或TACE小干扰RNA的细胞中未检测到这种分裂。TACE介导的Pref-1外结构域脱落抑制3T3-L1细胞和转Pref-1A的Pref-1-null小鼠胚胎成纤维细胞的脂肪细胞分化。TACE是负责将膜结合Pref-1转化为生物活性扩散形式的主要蛋白酶，这为Pref-1在脂肪细胞分化中的功能提供了新的见解。

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数字

图1。
图1。
COS细胞中Pref-1A外结构域的裂解和释放。（A） Pref-1A和Pref-1A结构。Pref-1A有一个信号序列（黑匣子）、六个EGF重复序列（标记为1到6的盒子）、一个膜旁区域（Jm）、跨膜结构域（Tm）和一个细胞质结构域（Cy）。Pref-1A具有胞外域蛋白水解加工位点（P），产生50kDa的大可溶性形式。全长Pref-1A构建体在胞外域含有HA标签，在C末端含有V5标签。突变体Pref-1A结构体具有21-氨基酸缺失，对应于加工位点P。（B）COS细胞被携带控制载体的慢病毒或带有HA标记的Pref-1A构造体（Pref-1A）感染过夜，并在选择培养基中培养10天，如材料和方法中所述。在培养基和细胞裂解液中分别用抗HA抗体进行Western blotting检测大可溶性形式（50kDa）和全长膜形式（65kDa。分子量标记如左图所示。（C） 稳定表达Pref-1A的COS细胞用无血清DMEM广泛洗涤两次，并在37°C和5%CO下培养2在含有下列试剂之一的无血清DMEM中放置1小时：100μM h2O（运行）2，100μM渗透酸盐（V2O（运行）7)1μM钙离子载体（A23187）、0.1%二甲基亚砜、1μM PMA、1 M氯化钠高盐，紫外线照射1h。用抗HA抗体Western blot分析检测培养基中Pref-1A的释放。
图2。
图2。
PMA诱导Pref-1A外结构域脱落。（A） 将稳定表达Pref-1A的COS细胞加入或不加入PMA（最终浓度为1μM）或载体DMSO（0.2%，[vol/vol]），作为无血清DMEM中的对照，处理指定时间。收集上清液和细胞裂解液，并用抗HA抗体进行免疫印迹（上面板）。在每个时间点对培养基中50-kDa可溶性Pref-1进行量化，结果表示为用PMA刺激120分钟后培养基中存在的Pref-1的百分比（下面板）。（B） 用指定浓度的PMA处理稳定表达Pref-1A的COS细胞60分钟。孵育培养基进行SDS-PAGE并用抗-HA抗体进行免疫印迹（上面板），并对每种PMA处理浓度的培养基中的Pref-1A进行定量，表示为用10μM PMA处理后培养基中发现的50-kDa可溶性Pref-1数量的百分比（下面板）。显示了至少三个独立实验的代表性结果。
图3。
图3。
Pref-1A胞外区脱落依赖金属蛋白酶。（A） 如图所示，稳定表达Pref-1A的COS细胞用无血清DMEM（−）、0.2%DMSO或金属蛋白酶抑制剂GM6001（30μM）预处理15分钟，然后在无血清DMTEM（−）或含有或不含有PMA（1μM）、GM6001或DMSO（0.2%）的培养基中再培养60分钟。孵育液用抗HA抗体进行免疫印迹（上面板）。对条件培养基中的Pref-1A进行了量化，结果表示为经PMA处理的细胞在条件培养基上发现的Pref-1A的百分比。（B） 用PMA（1μM）和不同浓度的GM6001处理稳定表达Pref-1A的COS细胞60分钟。用抗HA抗体的Western blotting检测培养基中Pref-1A分泌情况（上图）。对条件培养基中的Pref-1A进行了量化，结果表示为仅用PMA处理的条件培养基的Pref-1A百分比。（C） 突变体Pref-1A结构体代表具有对应于加工位点P的21氨基酸缺失的Pref-1A构造体（图1A）。稳定表达Pref-1A和突变Pref-1A的COS细胞均用培养基DMSO（0.2%）或PMA（1μM）处理60分钟。培养基和细胞裂解物用HA或V5表位标签抗体进行免疫印迹。（D） 用无血清DMEM（−）、DMSO、100μM TAPI-0和5μg TIMP-1、TIMP-2和TIMP-3/ml预处理稳定表达Pref-1A的COS细胞15分钟，并在添加或不添加1μM PMA的情况下培养60分钟。使用培养基和细胞裂解物与抗HA抗体进行Western blotting。显示了至少三个独立实验的代表性结果。
图4。
图4。
TACE在Pref-1脱落中的作用。图示为Myc-tagged TACE构造。S、 PRO、MP、DIS、CYS、TM和CYT分别代表信号序列、前体蛋白、金属蛋白酶结构域、去整合素结构域、富含半胱氨酸结构域、跨膜结构域和细胞质区域。Myc表位添加在C末端。（A） 用含有慢病毒的对照载体或表达TACE的载体感染稳定表达Pref-1A的COS细胞。然后用DMSO或PMA处理细胞60分钟。使用抗HA抗体在培养基和细胞裂解液中检测到Pref-1A蛋白，使用抗TACE抗体在裂解液中检查到TACE蛋白。分子量标记如右图所示。（B） 用携带Pref-1A结构体（Pref-1A）或Pref-1A和TACE表达载体（Pref-1A/TACE）的慢病毒感染3T3-L1细胞过夜。在感染后48小时，细胞在无血清培养基中培养指定的时间段。分别使用抗HA抗体和抗Myc抗体通过Western blot分析检测培养基中Pref-1A的可溶性和膜形式以及细胞裂解物中的TACE和细胞裂解物。显示了至少三个独立实验的代表性结果。
图5：。
图5：。
TACE突变CHO细胞中的Pref-1胞外结构域脱落。（A） 脱落缺陷的CHO-M2细胞及其亲代CHOT细胞被携带HA标记Pref-1A的慢病毒稳定感染。用抗HA抗体检测CHO-M2细胞和CHOT细胞裂解液中的Pref-1A蛋白。将感染Pref-1A慢病毒的COS细胞的细胞裂解物作为阳性对照。（B） 用DMSO（0.2%）和PMA（1μM）处理稳定表达Pref-1A的CHO-M2和CHOT细胞60分钟。使用抗HA抗体在培养基和细胞裂解液中检测到Pref-1A蛋白。显示了三个独立实验的代表性结果。
图6。
图6。
脂肪组织、3T3-L1细胞和MEF中TACE的表达。从3周龄和8周龄C57BL/6小鼠附睾脂肪组织、融合的3T3-L1细胞、分化的3T3_L1脂肪细胞、野生型MEF和分化的MEF中提取总RNA。每个样品中的总RNA的一微克用于RT.RT-PCR分析TACE、Pref-1和PPARγ的表达。以GAPDH（甘油醛-3-磷酸脱氢酶）为对照。显示了至少三个独立实验的代表性结果。
图7。
图7。
TACE介导的Pref-1释放对3T3-L1脂肪细胞分化的影响。（A） 将3T3-L1细胞感染对照慢病毒（A和d）和Lenti-TACE病毒（b和e）过夜，并在没有（A、b、d和e）或（c和f）GM6001的情况下对细胞进行分化，如材料和方法所述。显微镜下的细胞（a至c）和油红O染色显示脂质积聚（d至f和右侧面板）。脂肪细胞标志物、PPARγ和C/EBPα的cDNA分别为32P标记并用于Northern印迹分析。28S和18S rRNA显示为加载控制（左下面板）。我们使用1μg总RNA进行RT-PCR分析，以确定脂肪细胞标记物、ADSF/抵抗素、脂联素、FAS和瘦素的mRNA水平。β-肌动蛋白作为对照（右下面板）。显示了至少三个独立实验的代表性结果。（B） TACE的siRNA抑制TACE表达并调节Pref-1脱落。用对照siRNA或TACE siRNA转染稳定表达Pref-1A的COS细胞。转染30小时后，将细胞在无血清培养基中培养指定的时间段。用抗HA抗体免疫印迹法检测培养基和裂解液中的50-kDa Pref-1胞外区和Pref-1膜形式，用抗TACE抗体检测裂解液中TACE。分子量标记如右图所示。（C） TACE的siRNA抑制Pref-1脱落并促进脂肪细胞分化。用对照siRNA转染3T3-L1对照细胞并感染对照慢病毒。与对照细胞相比，Lenti-TACE病毒感染抑制脂肪细胞分化；相反，TACE siRNA转染增强了脂肪细胞分化。显示了脂质积聚的油红色O染色（上图）。PPARγ和C/EBPα的cDNA分别为32P标记并用于Northern印迹分析。28S和18S rRNA显示为加载控制（左下面板）。我们使用1μg总RNA进行RT-PCR分析，以确定脂肪细胞标记物、ADSF/抵抗素、脂联素、FAS和瘦素的mRNA水平。GAPDH被用作对照（右下面板）。显示了两个独立实验的代表性结果。
图7。
图7。
TACE介导的Pref-1释放对3T3-L1脂肪细胞分化的影响。（A） 将3T3-L1细胞感染对照慢病毒（A和d）和Lenti-TACE病毒（b和e）过夜，并在没有（A、b、d和e）或（c和f）GM6001的情况下对细胞进行分化，如材料和方法所述。显示了显微镜下的细胞（a至c）和用于脂质积聚的油红O染色（d至f和右图）。脂肪细胞标记物、PPARγ和C/EBPα的cDNA分别为32P标记并用于Northern印迹分析。28S和18S rRNA显示为加载控制（左下面板）。我们使用1μg总RNA进行RT-PCR分析，以确定脂肪细胞标记物、ADSF/抵抗素、脂联素、FAS和瘦素的mRNA水平。β-肌动蛋白作为对照（右下面板）。显示了至少三个独立实验的代表性结果。（B） TACE的siRNA抑制TACE表达并调节Pref-1脱落。用对照siRNA或TACE siRNA转染稳定表达Pref-1A的COS细胞。转染30小时后，将细胞在无血清培养基中孵育指定的时间段。用抗HA抗体免疫印迹法检测培养基和裂解液中的50-kDa Pref-1胞外区和Pref-1膜形式，用抗TACE抗体检测裂解液中TACE。分子量标记如右图所示。（C） TACE的siRNA抑制Pref-1脱落并促进脂肪细胞分化。用对照siRNA转染3T3-L1对照细胞并感染对照慢病毒。与对照细胞相比，Lenti-TACE病毒感染抑制脂肪细胞分化；相反，TACE siRNA转染增强了脂肪细胞分化。油红O染色显示脂质积聚（上面板）。PPARγ和C/EBPα的cDNA分别为32P标记并用于Northern印迹分析。28S和18S rRNA显示为加载控制（左下面板）。我们使用1μg总RNA进行RT-PCR分析，以确定脂肪细胞标记物、ADSF/抵抗素、脂联素、FAS和瘦素的mRNA水平。GAPDH被用作对照（右下面板）。显示了两个独立实验的代表性结果。
图8。
图8。
TACE对MEF脂肪细胞分化的影响。（A） 从Pref-1 KO和野生型（WT）胚胎分离的MEF中提取的总RNA用于Northern blot分析，以检测Pref-1和TACE的表达水平（左图）。用对照siRNA或TACE siRNA转染Pref-1 KO和WT MEF，然后用分化诱导剂处理。分化后从细胞中提取总RNA并用于Northern blot分析。Pref-1、TACE、PPARγ和C/EBPα的cDNA分别为32P标记并用于杂交（右侧面板）。28S和18S rRNA被用作负荷对照。（B） Pref-1 KO MEF分别感染对照慢病毒、Lenti-TACE病毒或Lenti-TACE和Lenti-Pref-1病毒。图中显示了油脂堆积的油红O（左侧面板）。显示了脂肪细胞标记物、PPARγ、C/EBPα、28S和18S rRNA的Northern blot分析作为负荷控制（右侧面板）。显示了两个独立实验的代表性结果。
图9：。
图9：。
TACE对MEF脂肪细胞分化的影响主要通过Pref-1。（A） KO MEF感染对照慢病毒（A和e）、Lenti-Pref-1A病毒（b至d和f至h）或Lenti-TACE病毒（c和g）表达载体或转染对照siRNA（A至c和e至g）或TACE siRNA（d和h）。显微镜下的细胞（a到d）和油红O显示脂质积聚（e到h和B，上面板）。PPARγ和C/EBPα的cDNA分别为32P标记并用于Northern印迹分析。28S和18S rRNA显示为加载控制（B，左下面板）。我们使用1μg总RNA进行RT-PCR分析，以确定脂肪细胞标记物、ADSF/抵抗素、脂联素、FAS和瘦素的mRNA水平。β-肌动蛋白作为对照（B，右下面板）。显示了至少三个独立实验的代表性结果。
图9：。
图9：。
TACE对MEF脂肪细胞分化的影响主要通过Pref-1。（A） KO-MEFs用对照慢病毒（A和e）、Lenti Pref-1A病毒（b至d和f至h）或表达Lenti TACE病毒（c和g）的载体感染，或用对照siRNA（A至c和e至g）或TACE siRNA（d和h）转染。显微镜下的细胞（a到d）和油红O显示脂质积聚（e到h和B，上面板）。PPARγ和C/EBPα的cDNA分别为32P标记并用于Northern印迹分析。28S和18S rRNA显示为加载控制（B，左下面板）。我们使用1μg总RNA进行RT-PCR分析，以确定脂肪细胞标记物、ADSF/抵抗素、脂联素、FAS和瘦素的mRNA水平。β-肌动蛋白作为对照（B，右下面板）。显示了至少三个独立实验的代表性结果。
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