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.2006年7月10日；203(7):1795-803.
doi:10.1084/jem.20060792。 Epub 2006年6月19日。

IPS-1在RNA病毒天然免疫应答中的重要作用

希曼舒·库马尔 1, 塔罗·卡瓦伊, 加藤浩子, 佐藤信太郎, 肯·高桥, Cevayir Coban公司, 山本正弘, Satoshi Uematsu先生, Ken J石井, 竹内修（Osamu Takeuchi）, 石佐·阿基拉（Shizuo Akira）
附属公司

IPS-1在RNA病毒天然免疫应答中的重要作用

希曼舒·库马尔等。 实验医学杂志. .

摘要

干扰素-β启动子刺激器（IPS）-1最近被鉴定为视黄酸诱导基因I（RIG-I）和黑色素瘤分化相关基因5（Mda5）的适配器，可识别不同的RNA病毒。这里我们展示了IPS-1在体内抗病毒反应中的关键作用。IPS-1缺陷小鼠在RIG-I和Mda5介导的I型干扰素和炎性细胞因子诱导方面均表现出严重缺陷，并且易受RNA病毒感染。在IPS-1缺陷细胞中，RNA病毒诱导的干扰素调节因子-3和核因子-κB活化也受到损害。然而，IPS-1对DNA病毒或双链B-DNA的反应并不是必需的。因此，IPS-1是RIG-I和Mda5信号传递中的唯一适配器，可调节对多种RNA病毒的有效反应。

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数字

图1。
图1。
IPS-1缺陷小鼠的产生。（A） 显示了小鼠IPS-1基因的基因组结构、靶向载体和预测的突变等位基因。黑色和白色方框分别表示编码外显子和非编码外显基因。E、 EcoRI.（B）杂合子杂交后代的Southern blot分析。提取基因组DNA，用EcoRI消化，电泳，并与a中所示的探针杂交。印迹显示野生型（+/+）有一条11.3 kb的单一带，纯合子突变体（−/−）有一个7.0 kb的带，杂合子小鼠（+/-）有两条带。（C） IPS-1基因表达的Northern blot分析。从野生型（+/+）和纯合突变型（−/-）小鼠制备的MEF中提取总RNA（30μg），电泳并与IPS-1杂交(IP第1页)或β-肌动蛋白(Actb公司)探针。（D） 免疫印迹分析IPS-1蛋白的表达。用抗IPS-1抗体（IP）对四个独立的MEF进行裂解和免疫沉淀，然后用抗IPS-1抗体（IB）进行印迹。用抗细胞外信号调节激酶1/2抗体同时印迹全细胞裂解物（WCL）。
图2。
图2。
IPS-1缺陷细胞对各种RNA病毒的反应受损。来自野生型（+/+）和IPS-1缺陷小鼠（−/-）的（A和B）MEF感染NDV（感染多重性[moi]=1.0）、VSV NCP突变株（VSV；moi=0.1）；或SeV-Cm突变株（SeV；moi=0.1）。24小时后，用ELISA（A）测定培养上清中细胞因子的浓度。孵育指定时间后，提取总RNA并进行Northern blot分析，以确定各个基因的表达模式（B）。星号表示未检测到。指示值为三份的平均值±SD。（C） B220型−CD11c公司+FL-DC感染VSV NCP（moi=1.0）或用3μM D35刺激。24h后，细胞固定并用抗CD86抗体染色。（D） 用指定长度的dsRNA刺激野生型（+/+）和IPS-1缺陷小鼠（−/-）的MEF。24小时后，用ELISA测定培养上清液中IFN-β的浓度。星号表示未检测到。指示值为三份的平均值±SD。（E） 用D35刺激脾细胞。24小时后，用ELISA测定培养上清中细胞因子的浓度。星号表示未检测到。指示值为三份的平均值±SD。（F） 用10μg/ml LPS刺激MEF。在2、4和6小时后Cxc110型和白介素-6通过Northern blot分析确定。
图3。
图3。
IPS-1缺陷细胞对EMCV和poly（I:C）的反应受损。（A和B）从野生型和IPS-1缺陷小鼠分离的PEC感染了EMCV（moi=0.1）。24小时后，用ELISA（A）测定培养上清中细胞因子的产生。在6和9小时后，提取总RNA，并进行RT-PCR分析，以了解各个基因（B）的表达。星号表示未检测到。指示值为三份的平均值±SD。（C） 用指定浓度的poly I:C（pIC）转染MEF。24小时后，通过ELISA测定培养上清液中细胞因子的产生。星号表示未检测到。指示值为三份的平均值±SD。（D） 用10μg/ml poly I:C转染MEF，并培养指定时间。对总RNA进行Northern blot分析，以检测相关基因的表达。（E） IPS-1型+/−和IPS-1−/−小鼠静脉注射poly I:C（200μg/体）。在注射前（0 h）或注射后2、4和8 h制备血清，并用ELISA测定细胞因子的浓度。从三个独立的实验中获得了类似的结果。
图4。
图4。
IPS-1缺陷细胞对NDV的反应中NF-κB和IRF-3活化受损。（A–E）野生型和IPS-1缺陷型MEF在NDV感染（moi=0.1）或LPS（10μg/ml）刺激后培养指定的时间段。使用NF-κB特异性探针（A）对核提取物进行电泳迁移率变化分析，并使用抗RelA抗体（B）进行免疫印迹分析。使用抗IRF-3抗体（C）对全细胞裂解产物进行自然聚丙烯酰胺凝胶电泳分析，使用抗磷酸STAT1（p-STAT1）和抗STAT1抗体（D）进行免疫印迹分析。对总RNA进行RT-PCR分析，以表达Irf7型和Actb公司（E） ●●●●。
图5。
图5。
IPS-1在体内抗病毒反应中的作用。（A） 野生型和IPS-1缺陷小鼠(n个=2）静脉注射EMCV（107PFU）。注射后4h收集血清，ELISA法检测细胞因子水平。数据来自两个独立实验的一个代表性实验。（B） 野生型和IPS-1缺陷小鼠(n个=7）腹腔内感染EMCV（102PFU）。监测这些小鼠的存活时间长达4天。（C）IPS-1+/−和IPS-1−/−(n个=3）腹腔内感染EMCV（102PFU）。感染48小时后，通过斑块分析定量心脏中的病毒产量。（D） 野生型和IPS-1缺陷小鼠(n个=6）鼻内感染VSV（4×6PFU）。对这些小鼠的生存期进行了长达9天的监测。（E）野生型和IPS-1缺陷型小鼠(n个=2）鼻内感染VSV（4×106PFU）。感染72小时后，通过菌斑试验对肝脏和大脑中的病毒产量进行量化。星号表示未检测到。
图6。
图6。
IPS-1在B-DNA介导反应中的作用。（A和B）用10μg/ml B-DNA转染野生型和IPS-1缺陷型MEF。24 h后，用ELISA（A）测定IFN-β、IP-10和IL-6的浓度。在2、4和6小时后，提取总RNA并进行Northern blot分析，以确定各个基因的表达模式（B）。星号表示未检测到。指示值为三份的平均值±SD。（C和D）MEF感染10例7PFU MVAΔE3L。培养24和48小时后，用ELISA（C）测定IFN-β和IL-6的浓度。使用抗MVA抗体（D）对全细胞裂解物进行免疫印迹分析。
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