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.2006年5月23日；103(21):8203-8.
doi:10.1073/pnas.0602566103。 Epub 2006年5月22日。

具有双重特异性的工程病毒疫苗构建物：禽流感和新城疫

Man-Seong公园 1, 约翰·斯蒂尔, 阿道夫·加西亚·萨斯特雷, 大卫·斯韦恩, 帕雷斯
附属公司

具有双重特异性的工程病毒疫苗构建物：禽流感和新城疫

Man-Seong公园等。 美国国家科学院程序. .

摘要

H5和H7血凝素亚型禽流感病毒和新城疫病毒（NDV）是世界各地家禽的重要病原体。具体而言，高致病性H5N1禽流感病毒是一个特别的威胁，因为它现在已经在几个大陆的40多个国家发生。由于全世界大多数鸡都接种了NDV活疫苗，我们开始开发具有双重特异性的疫苗原型，并允许对禽流感和纽卡斯尔病进行单一免疫。利用反向遗传学方法，我们构建了一种嵌合禽流感病毒，该病毒表达NDV血凝素-神经氨酸酶基因的外域，而不是H5N1禽流感病毒的神经氨酸蛋白酶蛋白。我们创造二价疫苗的第二种方法是在融合性和减毒NDV背景下表达H7禽流感病毒血凝素的外结构域。外源基因（仅包含其胞外结构域，其跨膜和细胞质结构域衍生自NDV的F蛋白）插入NDV基因组导致嵌合病毒，外源蛋白增强了病毒颗粒的掺入。用这种改进的疫苗原型病毒对鸡进行一次免疫，不仅能对H7N7高致病性禽流感病毒产生90%的保护作用，而且还能对高致病性NDV产生完全免疫。我们建议开发嵌合构建体，以便在鸡和其他家禽中方便、负担得起和有效地接种禽流感和新城疫疫苗。

PubMed免责声明

利益冲突声明

利益冲突声明：西奈山医学院拥有负链RNA病毒（A.G.-S.和P.P.）反向遗传学的专利地位。

数字

图1。
图1。
产生含有嵌合NA-HN片段的转染流感病毒。(A类)编码流感病毒NA NDV HN嵌合片段的病毒RNA（vRNA）示意图。vRNA由WSN NA vRNA的前127个核苷酸组成，其中包括非编码区的19个核苷酸和编码细胞质尾部、跨膜结构域和NA柄起点的核苷酸。该结构域之后是编码NDV HN蛋白51–576氨基酸的核苷酸，包括HN外结构域和串联终止密码子（TAG-TAG）。最后一个结构域表示WSN NA ORF 5′端的185个核苷酸（157个核苷酸）及其5′非编码区（28个核苷酸）。(B类)纯化重组VN/HN病毒的vRNAs。从重组WT WSN和VN/HN病毒中提取的RNA通过含有7M尿素的2.8%聚丙烯酰胺凝胶分离，并通过银染进行可视化。显示了聚合酶（Ps）、HA（WSN）、HAlo（VN 1203）、NP、M和NS片段的位置。编码NA蛋白的RNA在VN/HN病毒中缺失。显示了一条污染的18S核糖体RNA带。(C类)cHN蛋白的表达。MDCK细胞被流感病毒VN/HN或WT WSN感染。感染细胞在37°C下培养16小时，固定并用甲醇渗透。用抗NDV HN单克隆抗体（7B1）、抗H1流感HA单克隆抗体和多克隆抗H5流感HA血清通过免疫荧光法检测病毒中的特异性抗原。
图2。
图2。
rNDV F蛋白裂解位点的修饰。(A类)rNDV/B1基因组的示意图，其F蛋白的切割位点有两个或三个氨基酸变化。已知这些修饰的切割位点被普遍存在的蛋白酶识别。F蛋白中被裂解的肽键用斜线表示。(B类)用修饰F蛋白感染rNDV的CEF细胞中的合胞体形成。CEF细胞感染rNDV/B1、rNDV/F2aa和rNDV/F3aa病毒，感染倍数为0.001。感染细胞在37°C下孵育，然后通过免疫荧光分析每24小时监测细胞融合的病毒传播。
图3。
图3。
表达HPAI H7 HA蛋白的融合性rNDV载体的构建和鉴定。(A类)rNDV/F3aa-嵌合H7 cDNA构建的示意图。H7 HA蛋白的外结构域与NDV F蛋白的跨膜结构域和胞质尾部融合。该嵌合H7 HA基因插入rNDV/F3aa载体的P和M基因之间。(B类)病毒生长动力学的比较。用每种病毒的100个形成斑点的单位接种10日龄鸡胚，并在不同时间点（接种后24、48和72小时）收集尿囊液。病毒滴度（组织培养50%感染剂量，TCID50)用抗NDV兔血清和抗兔IgG FITC标记的抗体（DAKO）通过免疫荧光测定法测定Vero细胞中的抗体。(C类)在感染rNDV的细胞中表达WT H7 HA蛋白或H7 HA嵌合蛋白。在感染后36小时收获受感染的细胞，并将细胞裂解物用于免疫印迹分析。(D类)与WT H7 HA蛋白相比，H7 HA嵌合蛋白在rNDV病毒中的掺入量增加。从感染的鸡胚尿囊液中纯化出rNDV/B1-H7和rNDV/F3aa-嵌合H7。在SDS/10%聚丙烯酰胺凝胶上分离rNDV/B1-H7或rNDV/F3aa嵌合H7的病毒蛋白。将病毒蛋白转移到硝化纤维素膜上，用抗鸡H7-HA多克隆抗体和抗鸡IgG过氧化物酶标记抗体（Jackson ImmunoResearch）通过化学发光检测H7-HA蛋白。
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