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。2006年5月10日；26(19):5256-64.
doi:10.1523/JNEUROSCI.0984-06.2006。

帕金森氏病脑线粒体复合体I氧化损伤亚单位，功能受损和组装错误

保拉·M·基尼 1, Jing Xie（音译）, 罗德里克·卡帕尔迪, 詹姆斯·贝内特（James P Bennett Jr）
附属公司

帕金森氏病脑线粒体复合体I氧化损伤亚单位，功能受损和组装错误

保拉·M·基尼等。 神经科学。 。

摘要

在散发性帕金森病（PD）患者的多个组织中发现了电子传输链（ETC）中线粒体复合物I催化活性的丧失，这是一些帕金森病模型神经毒素的一种特性。使用针对整个复合物I大组装体的特殊ETC亚单位特异性和复合物I免疫捕获抗体，我们定量了10例PD和12例年龄匹配对照（CTL）样本脑线粒体中ETC蛋白和复合物Ⅰ亚单位的蛋白氧化。我们测量了烟酰胺腺嘌呤二核苷酸（NADH）通过络合物I驱动的电子转移速率，并将其与络合物I亚基的氧化水平及其8kDa亚基的减少相关联。PD脑复合体I显示ND6增加11%，其8kDa亚基减少34%，含有47%以上的蛋白羰基，这些羰基定位于线粒体和核基因组编码的催化亚基。我们发现复合体II-V的ETC蛋白水平没有变化。通过将CTL脑线粒体与NADH在鱼藤酮存在下孵育，而不是通过外源性氧化剂，可以复制PD复合物I的氧化损伤模式。通过复合物I的NADH驱动的电子转移速率与复合物I蛋白的氧化状态呈负相关，与PD 8 kDa亚基的减少呈正相关。PD脑线粒体复合体I功能降低似乎是由于其催化亚单位从内部过程氧化而非外部氧化应激所致，并与复合体I组装错误相关。这种复合物I自动氧化可能源于线粒体或核编码亚单位、复合物I组装因子、鱼藤酮样复合物I毒素或某些组合的异常。

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数字

图1。
图1。
CTL和PD脑线粒体ETC亚单位的Western blot。所有图形均使用来自额叶皮层样品的相同线粒体制剂。显示CTL和PD线粒体样本的印迹图像。底部的表格给出了下面SDs的实际平均带密度。第页CTL组和PD组的比较值没有显示出任何显著差异。有关详细信息，请参见材料和方法。CI–CV，复杂I–V。
图2。
图2。
复合物I亚单位CTL和PD线粒体的Western blot。所有图形均使用来自额叶皮层样品的相同线粒体制剂。显示了CTL和PD线粒体样品的印迹图像，并如前所述定位了复合物I亚基带（Triepels等人，2001年；Murray等人，2003年）。底部的表格给出了实际的平均带密度以及下面的SDs。第页值表明20和8 kDa亚基存在显著差异。有关详细信息，请参见材料和方法。
图3。
图3。
免疫捕获复合物I样品中的蛋白质羰基水平。来自额叶皮层的相同线粒体制剂用于所有图形。显示了用DNPH、SDS-PAGE、转移和DNPH免疫染色衍生后，从三个CTL（CTL）和六个PD脑的10μg免疫捕获复合物I蛋白样品中获得的免疫印迹。最左边的带（“DNPH”）显示了DNPH蛋白标准物的位置和相对强度。箭头指向DNPH-胰蛋白酶抑制剂带，该带被用作标准，以使所有其他检测到的带正常化。MW标记带未显示。有关详细信息，请参见材料和方法。
图4。
图4。
顶部，NADH驱动的AmplexRed氧化实验示例。所示为从人类额叶皮层分离出的0.4 mg/ml线粒体蛋白的孵育典型结果，并在37°下孵育，添加指定的添加剂。左侧是CTL大脑的结果，右侧是PD大脑的结果。底部，电子流经复合体I.线粒体的图；IM、OM、线粒体内外膜；FMN，黄素单核苷酸；N-（x），Fe-S团簇；Q、 辅酶Q.改编自Genova等人（2004）。
图5。
图5。
NADH驱动的AmplexRed氧化的线粒体速率与复合物I带中的蛋白质羰基水平呈负相关。所示为免疫捕获复合物I中NADH驱动的线粒体AmplexRed氧化速率（表示为%CTL值）与蛋白质羰基光密度（SDS-PAGE凝胶中不同的DNPH带）的关系图。CTL样品为圆形，PD样品为方形；R（右）线性回归拟合值和第页显示了回归拟合的值。
图6。
图6。
NADH加鱼藤酮增加复合物I亚单位的氧化损伤。将CTL额叶皮质样品中的线粒体与所示成分一起培养75分钟，然后清洗，然后免疫捕获复合物I并分析蛋白质羰基，如材料和方法中所述。A类，[NADH]=125μ米、鱼藤酮（10μ米)在18、21、26、37、50和94 kDa的谱带中，DNPH反应性似乎增加。过氧化氢仅增加了～20kDa波段的DNPH反应性。B类，在其他两种CTL脑线粒体部分中，[NADH]高出10倍1.25 m米（通道1和3），鱼藤酮（10μ米，泳道2和4），但鱼藤酮明显增加了~26kDa带的能量。通道1和通道3来自1.25 m培养的单独CTL脑线粒体制剂米NADH公司。泳道2和4来源于用于产生泳道1和3的CTL线粒体制剂，但在添加10μ米鱼藤酮。
图7。
图7。
PD（方形）和CTL（圆形）脑线粒体中8 kDa复合物I亚基水平与NADH驱动的AmplexRed氧化速率（左）和复合物I（右）中蛋白质羰基水平之间的相关性。R（右）线性回归拟合值和第页显示了回归拟合的值。
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