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.2006年6月；18(6):1360-72.
doi:10.1105/tpc.106.041178。 Epub 2006年4月28日。

拟南芥生命周期中DNA甲基化的维持对亲本印记至关重要

波琳·朱利安 1, 基诺西塔, 尼尔·奥哈德, 弗雷德里克·伯杰
附属公司

拟南芥生命周期中DNA甲基化的维持对亲本印记至关重要

波琳·朱利安等。 植物细胞. 2006年6月.

摘要

印迹基因主要由父系或母系等位基因表达。迄今为止，在植物中识别的所有印记基因都在胚乳中表达。在拟南芥中，Polycomb组基因MEDEA（MEA）和FWA的母体印记已被明确证明。FWA上游的直接重复序列受到DNA甲基化的影响。然而，目前尚不清楚类似的顺式作用元件在多大程度上可能是控制母体印迹基因的保守分子机制的一部分。在这项工作中，我们发现多梳组基因FERTILIZATION-INDEPENDENT SEED2（FIS2）被印记。FIS2印迹的维持依赖于DNA甲基化，而DNA甲基化的丧失并不影响MEA印迹。DNA甲基化作用于FIS2上游的一个小区域，与FWA相关的DNA甲基化靶区不同。我们表明，FWA和FIS2印迹需要在植物的整个生命周期中保持DNA甲基化，包括雄性配子发生和胚乳发育。因此，我们的数据表明，植物中的亲本基因组印记依赖于依赖或独立于DNA甲基化的多种顺式元素和机制。我们认为，印记是在与植物繁殖进化相关的限制条件下进化的，而不是通过选择特定的分子机制。

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数字

图1。
图1。
FIS2型印记由DNA甲基化控制。（A）在野生型Col和野生型C24之间进行杂交后，在0.5、1.5和3 DAP下获得从西力克中提取的RNA的等位基因特异性RT-PCR。在中删除180-bpFIS2型野生型登录Col的编码序列允许区分Col金融服务2来自FIS2型入世抄本C24。只有FIS2型母体等位基因在发育中的种子中表达。相比之下，迷你3由双亲等位基因表达。（B）野生型胚珠和花粉杂交后在4 DAP获得的角果中提取的RNA的等位基因特异性RT-PCR金属1-3/金属1-3植物（Col）在整个生命周期中表现出维持DNA MET1的活性降低。与野生型杂交相比FIS2型父系等位基因在发育中的种子中表达，这些种子从金属1-3/金属1-3植物。（C）野生型植物与野生型植物相互杂交后5 DAP获得的西力克RNA的等位基因特异性RT-PCRMET1as公司植物。这个FIS2型当花粉由MET1as公司植物，在营养发育阶段，维持DNA MET1的活性降低（Finnegan等人，1996年）。（D）野生型植物与组蛋白甲基化或DNA甲基化受影响的不同突变体杂交后，在5 DAP时获得从西力克中提取的RNA的等位基因特异性RT-PCR。在中删除180-bpFIS2型野生型登录Col的编码序列允许区分ColFIS2型来自FIS2型材料中的转录本C24，Landsberg直立人（升呃)和Wassilewskija。C24表示为控件。只有母体等位基因FIS2型在野生型和纯合子突变体之间的相互杂交产生的种子中表达，用于控制DNA甲基化的其他途径拟南芥cmt3（Lindroth等人，2001）和数字资源1和干重2（曹和雅各布森，2002a）。KYP甲基化组蛋白3 Lys-9残基（Jackson等人，2002年；Tariq等人，2003年），而含有FIE甲基化组分3 Lys-27残基的Polycomb群复合物（Bastow等人，2004年）。指出了父系（p）和母系（m）等位基因。甘油醛-3-磷酸脱氢酶(GAPDH公司)用作加载控件。进行了No-RT对照分析，但未显示数据。
图2。
图2。
MET1以CpG富集区为目标FIS2型地点。（A）RT-PCR分析表明印迹基因鱼类和野生动物管理局和FIS2型在野生型加入Col的营养组织中不表达金属1-3纯合子突变植物导致鱼类和野生动物管理局但不是的FIS2型在树叶中。金属1-3/+植物，没有显示鱼类和野生动物管理局，用于图5A所示的实验中。GAPDH公司用作加载控件。（B）甲基化敏感限制性内切酶分析DNA甲基化麦克尔野生型Col叶片中的BC在FIS2型.对麦克尔BC在金属1/金属1背景，这表明MET1控制−3104到−1867区域的DNA甲基化。鱼类和野生动物管理局MET1甲基化的重复序列被用作对照（Kinoshita等人，2004）。（C）亚硫酸氢盐测序FIS2型5′区，包含一个200 bp的结构域，该结构域富含主要在CpG上的甲基化胞嘧啶残基（完整序列见在线补充图2）。用玫瑰花叶的基因组DNA进行分析。的结构FIS2型描述了基因组序列，起始密码子用0表示。外显子用黑框表示，5′和3′非翻译区用白框表示。部分平移融合的程度FIS2-GUS公司在示意性基因组结构下方指示。
图3。
图3。
母体控制FIS2型DME表示。（A）对芽（第11和12阶段）和花（第13阶段）的mRNA进行的RT-PCR分析表明鱼类和野生动物管理局表达和简化FIS2型中的表达式二甲醚-4纯合突变体与野生型C24的比较。GAPDH公司用作控件。（B）到（E）的影响二甲醚在FIS2-GUS公司表达式。（B）表达FIS2-格斯报告器构造二甲醚-2/+和二甲醚-4/+授粉前（BP）和授粉后2天。观察到三种不同的类型：无表达（白色）、少量表达（浅蓝色）和野生型表达（深蓝色）。误差条对应于标准偏差与每组测量值关联。（C）到（E）显示三类FIS2-格斯中的表达式二甲醚-4/+突变背景：无表达（白色；[中])，表情少（浅蓝色；【D】)和野生型表达（深蓝色；[电子]). 棒材=20μm。
图4。
图4。
的维护FIS2型和鱼类和野生动物管理局雄性配子发生时沉默。（A）在花粉发育期间金属1-3/+植物减数分裂产生的一半单倍体小孢子继承了金属1-3突变，另一半继承野生型MET1型等位基因。所有小孢子都继承了基因组的甲基化副本（灰色矩形）。DNA复制表1-3小孢子从甲基化模板（灰色/白色矩形）产生半甲基化DNA。半甲基化DNA在有丝分裂后由营养核（V）和生殖细胞核（G）遗传，生殖细胞核第二次分裂产生两个精子细胞（S）。分裂后，一个精子细胞继承了一个完全去甲基化的DNA拷贝（白色矩形），另一个精子继承了半甲基化DNA。营养核不参与受精。在精细胞成熟过程中，DNA复制（Durbary等人，2005），在受精时，所有来自金属1-3小孢子预计至少含有一个半甲基化拷贝。（B）从FWA-GFP/FWA-GFP公司,表1-3/+植物（共聚焦截面）。插图是表达FWA-GFP公司在营养细胞（V）和两个精子细胞中。棒材=5μm。（C）异位表达鱼类和野生动物管理局和FIS2型通过RT-PCR观察从雄蕊中纯化的RNA。GAPDH公司用作对照以评估相等量的RNA负载。DUO1型在花粉中特异性表达（Rotman等人，2005），并用作花粉mRNA提取的质量控制。
图5。
图5。
的印记鱼类和野生动物管理局和FIS2型在雄性配子发生过程中，胚乳依赖于保持沉默。的压印状态鱼类和野生动物管理局,测量、和FIS2型在野生型胚珠和金属1-3/+植物。（A）等位基因特异性RT-PCR检测鱼类和野生动物管理局野生型胚珠（L呃附加物）和花粉金属1-3/+植物。（对于Col登录，由于限制性多态性的消化是部分的，因此获得了两条带；最低的带是Col特异性的[3 DAP]。）我们使用金属1-3/+植物，不表达鱼类和野生动物管理局在营养组织中（见图2A）。尽管在野生型L之间杂交呃Col只表现出母体的表达鱼类和野生动物管理局等位基因鱼类和野生动物管理局父系等位基因在与金属1-3/+花粉。（B）和（C）因此，在2 DAP时FWA-GFP公司报告者由来自金属1-3/+植物（C）但不是来自野生植物（B）.（D）对野生型材料RLD和Col的杂交进行等位基因特异性RT-PCR检测到母体的表达测量等位基因，典型的测量压印（1 DAP）。测量如果金属1-3/+植物提供了测量父系等位基因。（E）野生型材料C24和Col之间的杂交只在母体中表达FIS2型典型等位基因FIS2型野生型胚乳中的印记状态。相比之下，等位基因特异性RT-PCR显示FIS2型野生型C24胚珠和金属1-3/+植物（Col加入；3 DAP）。（F）到（J）去除胚乳后胚乳发育的挽救FIS2型父系等位基因印迹金属1-3花粉。（F）和（H）增强子陷阱标记KS117的GFP荧光在小麦胚乳中均匀增加财务报表2纯合突变体（F）与野生型相比（H）在5DAP时仅限于胚乳后极。（G）授粉后fis2/fis2，KS117/KS117通过花粉从金属1-3/+在植株中，一半的种子表现出KS117的表达模式，类似于野生型胚乳中的KS117模式（星号）。这些种子还显示了细胞学改变在财务报表2胚乳([我]和[日本]).（一）由金融服务2其特征是合胞胚乳没有细胞化，胚胎对面的后极增大（Guitton等人，2004年）。（J）19%的种子通过杂交获得了这种表型性状的挽救fis2/fis2植物和金属1-3/+花粉。棒材=50μm(【B】,[中],[我]、和[日本])和200微米([女]到【H】).GAPDH公司用作RT-PCR分析的对照([答],【D】、和[英]).
图6。
图6。
的维护鱼类和野生动物管理局胚乳中的印记取决于MET1。（A）在2 DAP时，野生型胚珠与来自金属1-3/+,FWA-GFP/FWA-GFP公司植物，父系提供的等位基因的表达FWA-GFP公司在一半种子的胚乳中观察到。（B）和（C）强度FWA-GFP公司在胚乳发育过程中，表达量从2 DAP开始下降（B）至4 DAP（C）.（D）与之相反FWA-GFP公司父系表达金属1-3/+胚乳，四分之一的种子表达FWA-GFP公司胚珠间杂交的父系等位基因表1-3/+植物和花粉携带金属1-3/+和FWA-GFP/FWA-GFP公司.（E）和（F）四分之一的种子表达低水平的FWA-GFP公司 （E）并被认为是杂合子金属1-3。另外四分之一的种子表现出较高的持续表达FWA-GFP公司 （F）并且可能是纯合子金属1-3在胚乳中。棒材=80μm(【B】,[中],[英]、和[女]). 每个杂交的种子数显示在每个横条的上方。标准偏差为每个测量显示。HO，纯合子。
图7。
图7。
植物DNA甲基化对亲本基因组印记的双重控制模型。基因FIS2型和鱼类和野生动物管理局MET1的持续作用使其沉默，MET1将甲基化（粉红色圆圈）靶向每个基因特定启动子中的一个元素。MET1依赖性沉默FIS2型和鱼类和野生动物管理局在营养期、雄性配子发生和胚乳发育期间，当它保持父系（p）等位基因沉默时，需要。FIS2型和鱼类和野生动物管理局在雌性配子发生过程中，DNA糖苷酶DME激活了表达，导致受精后胚乳中的母体（m）等位基因表达。在胚乳中，父本通过MET1的持续作用保持沉默，而母本是活跃的，导致印记表达。
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