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.2006年4月11日；103(15):5911-6.
doi:10.1073/pnas.0508562103。 Epub 2006年4月4日。

衔接蛋白Nck与Fas配体相互作用：将死亡因子导向细胞毒性免疫突触

马库斯·莱托 1, 景倩, 安德烈亚斯·林克曼, 马修·拉特雷尔, 路易丝·拉罗斯, 迪特尔·卡布利茨, 奥特马尔·扬森
附属公司

衔接蛋白Nck与Fas配体相互作用：将死亡因子导向细胞毒性免疫突触

马库斯·莱托等。 美国国家科学院程序. .

摘要

Fas配体（FasL）是细胞毒性T淋巴细胞和自然杀伤细胞的关键死亡因子。它作为分泌溶酶体的跨膜蛋白储存在细胞内。激活后，这些囊泡被转运到细胞毒性免疫突触（IS），FasL暴露于细胞表面，通过其受体Fas（CD95）在靶细胞上的连接触发细胞死亡。我们认为FasL-associated Adapter蛋白Nck参与了含FasL分泌溶酶体向is的肌动蛋白依赖性运输。Nck与FasL富含脯氨酸的部分结合，并在293T细胞中共表达时改变其亚细胞分布。在T淋巴细胞中，内源性Nck与溶酶体相关FasL部分共定位。当T细胞克隆或株暴露于靶细胞时，蛋白质和分泌溶酶体的其他成分（即颗粒酶B或组织蛋白酶D）都被输送到细胞-细胞界面。目前的数据表明，T细胞受体的参与可促使携带Nck相关FasL溶酶体的酪氨酸激酶和肌动蛋白依赖性快速转运至接触区。我们的观察支持了之前的观点，即FasL独特的细胞质尾部对于其直接运输到细胞表面和组装细胞毒性is至关重要。

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利益冲突声明

利益冲突声明：未声明冲突。

数字

图1。
图1。
Nck与FasL和N-WASp结合。(A类)Nck的模块化组成。Nck包含三个N端SH3域（从N端到C端，分别称为第一、第二和第三SH3域）和一个C端SH2域。(B类)FasL选择性地与Nck的第二和第三SH3结构域相互作用。谷胱甘肽Sepharose珠上显示的GST融合蛋白与KFL-9细胞制备的裂解物孵育。含有抗FasL单抗NOK-1的沉淀作为阳性对照，GST作为阴性对照。显示了抗FasL和抗N-WASp免疫印迹。注意，融合蛋白并没有在等摩尔浓度下使用，以得出定量结合偏好的结论。
图2。
图2。
293T转染体中Nck与FasL的克隆化。GFP标记的WT-Nck和/或FasL在293T细胞中单独或共表达。转染后24小时，细胞固定、渗透，并用α-FasL单克隆抗体NOK-1和Alexa Fluor 546结合的山羊抗鼠IgG染色。样品通过共焦显微镜进行分析。从叠加图像中可以明显看出FasL和Nck的彩色化。
图3。
图3。
FasL与来自293T转染体的Nck共沉淀。293T细胞中Myc-tagged Nck变体与FasL瞬时共存。转染24 h后制备细胞裂解物，并将其分为两等分，以与抗myc mAb 9C11和抗FasL mAb NOK-1平行免疫沉淀（IP）。蛋白质转移到硝化纤维素膜上，然后进行蛋白质印迹（WB）。为了监测转染子中的蛋白质表达，将印迹剥离并用抗myc和抗FasL抗体染色。抗myc IP中共沉淀FasL的数量是由于共表达myc标记Nck变体的水平不同所致。
图4。
图4。
颗粒酶B、FasL和Nck在克隆CD4中的亚细胞分布+T细胞。(A类)组织蛋白酶D和lamp-1染色。组织蛋白酶D和lamp-1的平行染色表明，这两种标记都适用于所研究T细胞溶酶体室的可视化。(B类)组织蛋白酶D和颗粒酶B的克隆化(C类)组织蛋白酶D和FasL的结肠化。(D类)Nck和FasL的克隆化。FasL的表达仅限于颗粒结构，与Nck共定位。Nck本身在这些颗粒周围富集，但似乎也存在于胞浆中。
图5。
图5。
溶酶体组分中FasL和Nck的富集。未刺激JFL细胞的裂解物(A类)PHA爆破(B类)和克隆的CD4+T细胞(C类)通过密度梯度或差速离心进行分级，如材料和方法用SDS/PAGE分离等量的蛋白质，并用Western blotting进行分析。首先对这些印迹进行FasL染色，然后连续复制lamp-1、Nck和β-actin（除了C类).
图6。
图6。
克隆T细胞和B-LCL结合物中Nck和FasL的克隆化。如图所示，在固定和染色之前，克隆的T细胞与EBV转化的B-LCL细胞（*）共培养30分钟。抗体组合如下：抗pTyr单克隆抗体4G10、抗颗粒酶B单克隆抗体和抗FasL单克隆抗体NOK-1与Alexa Fluor 488-偶联的驴抗鼠IgG，以及抗组织蛋白酶D和抗Nck单克隆抗体-1与Alexa-Fluor 546-偶联的山羊抗兔IgG。用DAPI染色细胞核，用罗丹明结合的卵磷脂染色肌动蛋白丝，并记录透射光以观察细胞形状。
图7。
图7。
JFL和B-LCL共轭物中Nck和FasL的显色化。用EGFP标记的Nck构建物瞬时转染JFL细胞并与之共培养葡萄球菌肠毒素E脉冲B-LCL细胞20分钟，然后用罗丹明-球蛋白、抗FasL单克隆抗体NOK-1和Alexa Fluor 546结合的驴抗鼠IgG和DAPI进行固定和染色。(A类)WT-Nck过度表达。肌动蛋白丝、Nck和FasL在IS处积聚(B类)Nck在所有SH3结构域中过度表达并发生突变。肌动蛋白丝形成受阻，Nck在细胞质内均匀分布，含有FasL的小泡未运输到接触区。
图8。
图8。
Nck的部分敲除足以减少FasL转运和突触形成。PHA母细胞未经处理或转染对照siRNA或siRNA，通过使用Amaxa原代人类T细胞核感染试剂盒靶向Nck（程序X-001）。(A类)交付控制。24小时后通过FACS分析监测FAM标记的对照siRNA（暗线）在PHA母细胞中的有效转染(B类)72小时后全细胞裂解物的Western blot分析。在蛋白质水平上，Nck表达降低约50–60%。(C类)FasL在未经处理和siRNA-处理的T细胞母细胞中的分布。用NOK-1和Alexa Fluor 488-偶联驴抗鼠IgG对FasL进行染色。
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