A noncoding RNA is a potential marker of cell fate during mammary gland development

doi:10.1073/pnas.0600745103

.2006年4月11日；103(15):5781-6.

doi:10.1073/pnas.0600745103。 Epub 2006年3月30日。

非编码RNA是乳腺发育过程中细胞命运的潜在标志物

梅勒妮·R·金吉尔¹, 艾米·N·肖, 亚历杭德罗·孔特雷拉斯, 莫妮克·瑞恩克尔斯, 乔纳森·米勒, 玛丽亚·F·冈萨雷斯-瑞博, 杰弗里·罗森

附属公司

PMID： 16574773
预防性维修识别码：项目经理1420634
内政部： 10.1073/pnas.0600745103

非编码RNA是乳腺发育过程中细胞命运的潜在标记

梅勒妮·R·金吉尔等人。美国国家科学院程序. 2006.

.2006年4月11日；103(15):5781-6.

doi:10.1073/pnas.0600745103。 Epub 2006年3月30日。

作者

梅勒妮·R·金吉尔¹, 艾米·N·肖, 亚历杭德罗·孔特雷拉斯, 莫妮克·瑞恩克尔斯, 乔纳森·米勒, 玛丽亚·冈萨雷斯·里博, 杰弗里·罗森

附属

¹美国德克萨斯州休斯顿市贝勒广场1号贝勒医学院分子和细胞生物学系，邮编77030。

PMID： 16574773
预防性维修识别码：项目经理1420634
内政部： 10.1073/pnas.0600745103

摘要

PINC是一种大的、选择性剪接的、发育调控的非编码RNA，在腮腺退化的末端导管小叶单位样结构中表达。以前的研究表明，这种细胞群不仅具有祖细胞样的特性（乳腺增殖和重新繁殖的能力）和生存发育程序性细胞死亡的能力，而且还具有抑制致癌物诱导的增殖的能力。在这里，我们报道了PINC的表达在时间和空间上受体内发育刺激的调节，PINC RNA以细胞周期特异性的方式定位于细胞核或细胞质中的不同部位。功能丧失实验表明，PINC在细胞生存和细胞周期进展的调节中发挥双重作用，这表明PINC可能参与先前在腮腺末端导管小叶单位样结构中观察到的发育介导的变化。这是第一批描述大型哺乳动物非编码RNA功能特性的报告之一。

PubMed免责声明

利益冲突声明

利益冲突声明：未声明任何冲突。

数字

**图1。**
概述*PINC码*基因组区域。(A类)大鼠的图示*PINC码*显示主要6.3kb全长转录本PINC A（GenBank登录号AY035343）和替代转录本B（GenBank-登录号DQ099683）、C（GenBank-DQ099682）、D（GenBank-accession号DQ105700）、E（GenBank-DQ080210）、F（GenBank-accession编号DQ105701）和G（GenBank-G登录号。DQ080211）。显示了成绩单的大小。转录起始于负（−）链，并相对于大鼠基因组的正（+）链呈现。(B类)鼠标的图示*PINC码*显示从小鼠EST数据库鉴定的两个转录物（mPINC_1.6和mPINC-1.0）的转录位点。这些转录物包含由两个方框区域指示的独特的3′末端外显子。还显示了另一个EST克隆（GenBank登录号BE377788）的位置。所有三个转录物都从负（−）链开始，并相对于正（+）链呈现。标记了一个独立重叠转录单位的位置，该转录单位被鉴定为RIKEN克隆D530049I02（GenBank登录号AK021318）。AK021318是从正（+）链转录而来的。(C类)来自的图形输出多机制造商对齐*PINC码*使用大鼠基因组序列作为参考序列，从小鼠（2004年5月组装）、大鼠（2003年6月组装），人类（2004年6月装配）、黑猩猩、狗（2004年7月组装）和负鼠基因组中提取的区域和侧翼序列。图上方显示了大鼠主要转录本（GenBank登录号AY035343）外显子的转录方向和位置。彩色衬底显示的基因组特征包括保守外显子（浅紫色）、内含子（浅黄色）、小鼠中表达的替代外显子和推测的近端启动子（浅粉红色）。一个独立重叠基因（GenBank登录号AK024261）的外显子以浅橙色表示。

**图2。**
PINC的发育和组织特异性表达。(A类)PINC表达对不同激素方案的反应方法PINC RNA水平通过实时PCR分析，使用设计用于扩增大鼠PINC所有七种亚型的引物，并在归一化为细胞角蛋白8（乳腺上皮细胞标记物）水平时作为相对表达。PINC在妊娠18天的乳腺中的表达为阳性对照（注意使用不同的比例尺）。(B类)通过实时PCR（如上所述）评估42天龄处女大鼠（42d vir）、96天龄处男大鼠（96d vir. (C类)PINC的组织特异性表达。通过使用从一系列成人组织（大脑（B）、心脏（H）、肾脏（K）、肝脏（Li）、肺（Lu）、卵巢（O）、睾丸（Te）、胸腺（Th）、子宫（U）、处女乳腺（V）和妊娠中期乳腺（P）制备的RNA，通过RT-PCR检测PINC的表达。(天)整体安装就地通过使用检测PINC_1.6和PINC_1.0转录物的探针显示在10.5天的胚胎中PINC表达的杂交。在晶状体（L）、心脏（H）、前肢芽和后肢芽（LB）、鼻内裂（IC）、视网膜层（RL）、下颌弓（MA）和体节（S）中检测到表达。

**图3。**
PINC RNA在HC11细胞中的表达和细胞内定位。(A类和B类)FISH显示mPINC_1.0的本地化(A类)和mPINC_1.6(B类)HC11细胞中细胞周期不同阶段的RNA。同一场的DAPI染色图像并行显示。HC11细胞生长停滞72小时以同步细胞周期；返回正常生长培养基，然后在接下来的24小时内的不同时间点将细胞固定在盖玻片上，并进行FISH检查。使用反褶积显微镜获得图像（每个时间点10–12个独立场成像），并对代表性捕获的原始图像进行反褶聚，以生成高分辨率图像。（比例尺：10μm）(C类和天)mPINC_1.0的表达式(C类)和mPINC_1.6(天)RNA在细胞周期的不同阶段。HC11细胞生长停滞72 h，然后返回血清和生长因子。在细胞周期重入后的不同时间点从细胞中制备RNA（如图所示），并使用mPINC_1.0或mPINC-1.6特异性引物通过实时PCR分析RNA水平。将结果归一化为亲环素表达，并绘制为相对表达。*，*P（P）*< 0.05; ∗∗,*P（P）*< 0.005.

**图4。**
敲下mPINC_1.6会改变细胞周期进程。(A类)siRNA击倒策略。siRNA被设计为靶向mPINC_1.0和mPINC_1.6的独特3′-末端外显子中的序列（图示），以允许转录物特异性敲低每种mPINC亚型。(B类)免疫荧光检测转染siRNAs的HC11s中BrdU掺入对mPINC_1.0（1.0A）、mPINC-1.6（1.6A）或无关阴性对照寡核苷酸和模拟转染细胞的影响。将转染细胞生长停滞72小时，然后将正常生长培养基返回6小时以重新启动细胞周期。HC11s在固定前用BrdU标记45分钟，用抗BrdU的FITC-偶联抗体通过免疫荧光法测定BrdU掺入量。(C类)用免疫荧光法测定BrdU掺入量（如B类)并计算为六个独立显微镜场中BrdU阳性细胞相对于DAPI染色细胞核总数的平均百分比。敲除mPINC_1.6（1.6A）后，与转染阴性对照siRNA的细胞相比，BrdU阳性细胞的数量增加了16倍，*P（P）*< 0.002.

**图5。**
敲除mPINC_1.0在无血清条件下诱导细胞凋亡。(A类)计算用针对mPINC_1.0（siRNA 1.0A、1.0B和1.0C）、mPINC_1.6（1.6A）、阴性对照siRNA或模拟转染siRNA的siRNA转染的HC11s中TUNEL阳性细胞的百分比相对于DAPI染色的细胞核总数，*P（P）*< 0.0005; ∗,*P（P）*< 0.003. (B类)用抗mPINC_1.0（1.0A）或阴性对照寡核苷酸的siRNA转染HC11s，转染后在正常生长条件下维持48h，然后在无血清培养基中放置3h后固定。通过对切割的Caspase-3进行免疫荧光检测来检测Caspase-2的激活，并计算切割的Caspase-3阳性细胞相对于DAPI染色细胞核总数的百分比，*P（P）*< 0.0005; ∗,*P（P）*< 0.003. 针对mPINC_1.0的三个独立siRNA也获得了类似的结果（数据未显示）。

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