Nucleocapsid protein of SARS-CoV activates the expression of cyclooxygenase-2 by binding directly to regulatory elements for nuclear factor-kappa B and CCAAT/enhancer binding protein

doi:10.1016/j.biocel.2006.02.003

.2006;38(8):1417-28.

doi:10.1016/j.bicel.2006.02.003。 Epub 2006年3月3日。

SARS-CoV的核衣壳蛋白通过直接与核因子-κB和CCAAT/增强子结合蛋白的调节元件结合，激活环氧合酶-2的表达

闫晓红¹, 钱浩, 穆永新, 哈立德·阿明·蒂马尼, 林白叶, 朱颖（音）, 吴建国

附属公司

PMID： 16546436
预防性维修识别码： PMC7108415号
内政部： 2016年10月10日/j.bicel.2006.02.003

SARS-CoV的核衣壳蛋白通过直接与核因子-κB和CCAAT/增强子结合蛋白的调节元件结合，激活环氧合酶-2的表达

闫晓红等。国际生物化学杂志-细胞生物学. 2006.

.2006;38(8):1417-28.

doi:10.1016/j.bicel.2006.02.003。 Epub 2006年3月3日。

作者

闫晓红¹, 钱浩, 穆永新, 哈立德·阿明·蒂马尼, 林白叶, 朱颖（音）, 吴建国

附属

¹武汉大学生命科学学院病毒学国家重点实验室，武汉430072。

PMID： 16546436
预防性维修识别码： PMC7108415号
内政部： 2016年10月10日/j.bicel.2006.02.003

摘要

SARS-相关冠状病毒（SARS-CoV）引起肺部炎症和损伤，导致严重急性呼吸综合征。为了评估这一事件背后的分子机制，我们研究了SARS-CoV蛋白在调节促炎因子环氧合酶-2（COX-2）中的作用。测试单个病毒蛋白调节COX-2基因表达的能力。结果表明，COX-2启动子被核衣壳（N）蛋白以浓度依赖的方式激活。Western blot分析表明，N蛋白足以刺激哺乳动物细胞产生COX-2蛋白。COX-2启动子突变表明，COX-2转录的激活依赖于两个调节元件，一个核因子κB（NF-κB）结合位点和一个CCAAT/增强子结合蛋白（C/EBP）结合位点。电泳迁移率转移分析（EMSA）和染色质免疫沉淀（ChIP）证明SARS-CoV N蛋白直接与这些调控序列结合。蛋白质突变分析表明，N蛋白的富含Lys基序作为核定位信号，对COX-2的激活至关重要。此外，发现N蛋白功能需要一个富含亮氨酸的基序。68个残基序列被鉴定为激活COX-2表达所必需的潜在DNA结合域。我们提出，严重急性呼吸系统综合征冠状病毒N蛋白通过激活COX-2基因表达，直接与启动子结合，通过多种COX-2信号级联导致炎症，从而引起肺部炎症。

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图1
SARS-CoV N蛋白激活293T细胞中COX-2的表达。（A） SARS-CoV的单个开放阅读框架图，以及病毒基因组上的位置。（B）通过单个SARS-CoV蛋白分析COX-2启动子激活。分别用表达不同SARS-CoV蛋白的质粒和荧光素酶基因受COX-2启动子控制的报告质粒共转染293T细胞。通过标准程序测定相对荧光素酶活性。表达的基因如图A所示：13为阴性对照pCMV-Tag2，14为阳性对照pCMV Tag2-HBx（乙型肝炎病毒X蛋白）。（C）严重急性呼吸系统综合征冠状病毒N蛋白在COX-2启动子激活中的剂量依赖性分析。将表达N蛋白的不同数量质粒与报告质粒共转染293T细胞，测定其相对荧光素酶活性。值对应于至少三个重复独立实验的平均值。误差条显示1S。D.（D）N蛋白激活的COX-2蛋白表达的Western blot分析。用空载体pCMV-Tag2作为对照（通道1）或质粒pCMV-Tag-N转染细胞，表达SARS-CoV N蛋白（通道2）。制备细胞提取物，并使用兔抗COX-2抗体测定表达蛋白。（E）用N蛋白抗体对同一印迹进行Western blot分析。

图2
功能分析顺式-COX-2启动子的调节元件。个人示意图顺式-COX-2启动子的调控元件及其截短或位点特异性突变体显示在左侧面板中，荧光素酶活性测定的结果显示在右侧面板中。携带SARS-CoV N基因的质粒和由单个COX-2启动子突变体驱动的荧光素酶报告基因的质粒被共转染到293T细胞中。通过测量转染细胞裂解物中的相对荧光素酶活性来测定启动子活性。pCMV-Tag2被用作纯载体对照。荧光素酶活性对应于至少三个重复进行的独立实验的平均值。黑色符号表示突变。误差条显示1S。D。

图3
通过电泳迁移率变化分析（EMSA）测定SARS-CoV N蛋白和COX-2启动子之间的相互作用。EMSA是用转染N基因的293T细胞的核提取物（第4–6道）或不转染（第1–3道）进行的。探针是通过退火含有同源COX-2启动子区域的单链和末端标记寡核苷酸生成的。将核苷酸−132/−125（A）处的C/EBP或核苷酸−228/−204（B）处的NF-κB探针添加到所有反应中（泳道1-6）。在添加探针之前的预孵育过程中添加了未标记的双链寡核苷酸竞争对手（通道1和5）。对于超位移实验，在加入反应之前，将多克隆抗体与核提取物孵育（通道6）。样品在5%非变性聚丙烯酰胺凝胶上电泳，并通过放射自显影术进行可视化。箭头表示超移位的蛋白质-DNA复合物。

图4
通过染色质免疫沉淀（ChIP）分析测定SARS-CoV N蛋白和COX-2启动子之间的相互作用。对用空载体pCMV-Tag2转染的293T细胞（A中的通道1；B和C中的通道4）或表达N蛋白的pCMV-Tag2-N（A中通道2-4；B中通道1-3；C中通道1-3）进行裂解并进行ChIP分析。收集免疫沉淀复合物，进行PCR扩增，并通过琼脂糖凝胶电泳分离。（A）使用特异性引物（CP1和CP2）通过PCR扩增COX-2启动子区域（−502至−2）。（B） COX-2启动子区域（−243至−136）通过PCR使用NF-κB特异性引物（NFκB-CP1和NF-κ的B-CP2）扩增。（C）使用C/EBP-特异性引物（C/EBP-CP1和CP2）通过PCR扩增COX-2启动子区域（−155到−2）。

图5
通过序列缺失对SARS-CoV N蛋白进行功能分析。（A） SARS-CoV N蛋白的N端截断突变体图，以及通过测量N端截断N蛋白激活COX-2启动子的能力来确定其功能。（B） SARS-CoV N蛋白的C末端截断突变体图，以及通过测量其激活COX-2启动子的能力来确定C末端截断N蛋白的功能。293T细胞与含有表达不同截短蛋白的单个突变N基因和报告基因的质粒共转染。通过荧光素酶活性测定测定每个突变蛋白对COX-2启动子激活的影响。pCMV-Tag2被用作病媒控制。值对应于至少三个重复独立实验的平均值。误差条显示1S。D。

图6
N蛋白假定核定位信号的功能测定。（A） N蛋白及其缺失突变体的潜在核定位信号图和位置。删除38-PKQRRPQ-44的MutN1；删除220-LALLLDRLNRL-231的MutN2；删除257-KKPRQKR-263的MutN3；删除带有369-KKDKKK-376的MutN4。（B）缺失突变N蛋白的功能分析。293T细胞与携带表达突变N蛋白的基因的质粒和报告载体共转染。通过测定荧光素酶活性来确定缺失对N蛋白的影响。pCMV-Tag2被用作病媒控制。值对应于至少三个重复独立实验的平均值。误差条显示1S。D.（C）使用N蛋白抗体对转染细胞中表达的N蛋白进行蛋白质印迹分析。

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