Characterization of different isoforms of the HIF prolyl hydroxylase PHD1 generated by alternative initiation

doi:10.1042/BJ20051996

.2006年7月1日；397(1):179-86.

doi:10.1042/BJ20051996。

交替引发产生的HIF-脯氨酰羟化酶PHD1不同亚型的表征

田亚敏¹, 大卫·R·摩尔, 彼得·拉特克利夫, 乔纳森·M·格莱德

附属公司

PMID： 16509823
预防性维修识别码：项目经理1479752
内政部： 10.1042/BJ20051996

交替引发产生的HIF-脯氨酰羟化酶PHD1不同亚型的表征

田亚敏等。生物化学杂志. 2006.

.2006年7月1日；397(1):179-86.

doi:10.1042/BJ20051996。

作者

田亚敏¹, 大卫·R·摩尔, 彼得·拉特克利夫, 乔纳森·M·格莱德

附属

¹氧气传感小组，亨利·威康分子生理学大楼，牛津大学，罗斯福大道，牛津大学牛津牛津牛津牛津牛津牛津牛津牛津牛津大学。

PMID： 16509823
预防性维修识别码：项目经理1479752
内政部： 10.1042/BJ20051996

摘要

异二聚体转录因子HIF（低氧诱导因子）是氧调节基因表达的核心。三种氧依赖性脯氨酰羟化酶酶[PHD1（脯氨酸羟化酶域1）、PHD2和PHD3]控制HIF的丰度。在有氧的情况下，它们将HIF-α中的特定脯氨酸残基羟基化，允许pVHL（von Hippel-Lindau蛋白）识别，并随后进行泛素化和蛋白酶体破坏。因此，这些酶的精确作用和调节对于理解缺氧的生理和病理反应尤为重要。在本研究中，我们定义了两种PHD1的存在，并提供证据证明它们是由选择性翻译起始产生的。我们证明，这两种替代形式都具有生物活性，具有相似的HIF-脯氨酰羟化酶活性，但它们对雌激素、细胞汇合和蛋白酶体抑制的反应不同。我们发现两个PHD1物种受到蛋白水解调节，但它们的蛋白质稳定性显著不同。尽管每种亚型都有可能与Siah（七种缺失同源）泛素连接酶家族成员相互作用，但遗传学研究表明，其他蛋白水解机制负责在所研究的条件下控制稳定性。数据确定了调节细胞对缺氧反应的途径中存在进一步的控制水平。

PubMed免责声明

数字

**图1。两种PHD1蛋白在不同细胞系中的表达**
(一)A549、OVCAR3、ND21和BT474细胞提取物的免疫印迹检测PHD1。可以看到一对标记为p43和p40的两种物种。(b条)免疫印迹法检测用对照和PHD1 siRNA寡核苷酸处理的BT474细胞提取物中的PHD1，显示PHD1 siRNA抑制了两种PHD1(**c（c）**)免疫印迹法检测ZR751细胞在常压条件下和缺氧16h（1%O）后细胞提取物中的PHD1₂)，显示在缺氧条件下快速迁移物种（p40）的表达减少。

**图2。两种形式PHD1的内源性表达及与野生型、PHD1M1A和PHD1M34A蛋白IVTT合成的比较**
(一)免疫印迹法检测正常氧（21%O）处理的BT474细胞提取物中的PHD1₂)或缺氧（1%O₂)在有或没有蛋白酶体抑制剂MG132（25μM）的情况下持续16小时，以及通过用编码野生型PHD1的质粒编程的兔网织红细胞裂解物或小麦胚芽提取物（pcDNA3-PHD1）进行IVTT合成。在细胞提取物和IVTT合成中检测到两种具有类似迁移率的蛋白质。流动性更快的物种（p40）的蛋白酶体抑制水平增加，但在缺氧条件下降低。(b条)免疫印迹法检测用编码野生型PHD1（wt，pcDNA3 PHD1）或突变PHD1的质粒编程的兔网织红细胞裂解物中的PHD1。(**c（c）**)免疫印迹法检测兔网织红细胞裂解物中的PK，该裂解物由编码带有C末端PK表位标签（pcDNA3 PHD1PK）和突变版本（pcDNA4 PHD1M34APK）的野生型PHD1的质粒编程而成。

**图3。脉冲追踪研究检查两种PHD1的前体-产物关系**
(一)PHD1的脉冲追踪放射标记研究。ZR751细胞用[³⁵S] 蛋氨酸/半胱氨酸30分钟，然后孵育0、15、30、60或120分钟，然后用抗PHD1抗体mAb 112或对照抗体进行细胞提取物的免疫沉淀。用SDS/PAGE分离免疫沉淀物³⁵上部（p43）和下部（p40）物种的S信号通过磷光成像仪屏幕量化，并以图形方式显示在(b条).

**图4。两种PHD1的表达对雌激素、蛋白酶体抑制、缺氧和细胞融合的反应**
(一)免疫印迹法检测用雌激素（10 ng/ml雌二醇-17β）处理24或48 h和/或蛋白酶体抑制剂MG132（25μM）处理最后4 h的ZR751细胞的细胞提取物中的两种PHD1（p43和p40）。(b条)免疫印迹检测在不同汇合水平（50%、100%和100%+）培养的ZR751细胞和缺氧处理（“H”；1%O”）细胞提取物中的两种PHD1（p43和p40）₂)持续16小时，雌激素（‘E’；10 ng/ml雌二醇-17β）持续48小时，或雌激素持续48小时以及蛋白酶体抑制持续最后4小时（‘PI’；25μM MG132）C'，控制。

**图5。环己酰亚胺追踪法检测缺氧和常压条件下两种PHD1（p43和p40）的蛋白质稳定性**
U2OS细胞用编码野生型或突变型PHD1的质粒（Wt，pcDNA3 PHD1；M1A，pcDNA3 PHD1M1A；或M34A，pcDNA3 PHD1M34A）或无质粒转染，并用常氧（21%O₂)或缺氧（1%O₂)在用0.1 mM环己酰亚胺处理0、30、60或90分钟之前，持续16小时。免疫印迹法检测PHD1和PHD3的内源性和转染蛋白水平。

**图6。野生型、PHD1M1A和PHD1M34A酶的脯氨酸羟化酶活性**
对兔网织红细胞裂解物中合成的蛋白质进行分析，以确定其将HIF-1α肽（HIF-1β残基556–574）转化为VHL结合形式的能力。在兔网织红细胞裂解物IVTT中产生PHD1酶，通过SDS/PAGE和使用磷光成像仪的放射自显影术定量每个蛋白质的相对丰度，然后在分析中使用等摩尔量的酶。用酶处理与人类HIF-1α残基556–574相对应的N末端生物素化肽，然后与³⁵S-放射性标记VHL蛋白通过SDS/PAGE和放射自显影术定量。反应一式三份，结果以平均值±S表示。D.不同形式PHD1的酶活性之间没有统计上的显著差异。

**图7。PHD1表达对携带分离的HIF-α降解结构域的Gal4融合蛋白活性的影响**
用表达（i）Gal4报告基因、（ii）β-半乳糖苷酶、（iii）指示的HIF-αODD（氧依赖性降解域）序列作为Gal4–HIF–VP16融合蛋白[HIF-1α/NODD（氨基酸344–553）、HIF-1 al/CODD-（554–698）、HIF-2α/NOD-D-（345–517）或HIF-2α/CODD-（517–682）]和（iv）的质粒共同转染MCF7细胞如图所示，野生型PHD1（wt，pcDNA3 PHD1）或PHD1的突变型（M1A，pcDNA4 PHD1M1A）。分析荧光素酶活性，并通过β-半乳糖苷酶活性校正转染效率。显示了PHD1蛋白表达水平的免疫印迹分析。实验一式三份，结果以平均值±S表示。D.在不同形式的PHD1的作用之间没有发现统计上的显著差异。

**图8。Siah E3连接酶过表达对PHD1丰度的影响**
(一)用FLAG标记的Siah编码表达质粒（pcDNA3-FLAG-Siah1、pcDNA3-FLAG-Siah2或pcDNA3_FLAG-Siaa2）将编码PHD1M1A（pcDNA4 PHD1M1；1600 ng）或PHD1M34A（pcDNA A3 PHD1M34 A；100 ng）的质粒转染到MCF7细胞中^房间; 100纳克）。通过免疫印迹检测不同形式的内源性和转染的PHD1的丰度。Siah2（以及在较小程度上Siah1）降低了两种形式转染PHD1的蛋白质水平。(b条)在U2OS细胞中，在没有蛋白酶体抑制剂MG132和存在蛋白酶体抑制剂的情况下，进行了类似的实验来检测Siah表达对PHD1M1A的影响。(**c（c）**)HEK-293T细胞与编码PHD1M1A（pcDNA3-PHD1M1A）或PHD1M34A（pcDNA A3-PHD1M34A）的质粒共转染，并带有或不带有编码FLAG–Siah2的质粒^房间（pcDNA3-FLAG-Siah2）^房间). Siah2之间存在特定关联^房间和PHD1。然而，PHD1的较慢流动性物种在输入中占主导地位，而较快流动性形式在免疫沉淀中占主导地位。

**图9。Siah抑制或缺乏对PHD1表达的影响**
用Siah靶向siRNA寡核苷酸处理MCF7细胞以抑制Siah1水平(一)，西亚2(b条)或者Siah1和Siah2(**c（c）**)并检测提取物中PHD1、HIF-1α、PHD3和Siah蛋白的表达。(d日)MEF来源于*西亚1a*^−/−/*西亚2*^−/−或野生型（wt）小鼠接受常氧（‘N’；21%O₂)、蛋白酶体抑制（'P'；25μM MG132）或缺氧（'H'；5%O₂)持续5小时。通过免疫印迹检测细胞提取物中PHD1、HIF-1α、PHD3和β-微管蛋白的表达。

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