Two di-leucine motifs regulate trafficking of mucolipin-1 to lysosomes

doi:10.1111/j.1600-0854.2006.00387.x

.2006年3月；7(3):337-53.

doi:10.1111/j.1600-0854.2006.00387.x。

两个二亮氨酸基序调节粘蛋白-1向溶酶体的转运

Silvia Vergarajauregui公司¹, 玫瑰Puertollano

附属公司

PMID： 16497227
预防性维修识别码：项目经理1413585
内政部： 10.1111/j.1600-0854.2006.00387.x号

两个二亮氨酸基序调节粘蛋白-1向溶酶体的转运

Silvia Vergarajauregui公司等。交通. 2006年3月.

.2006年3月；7(3):337-53.

doi:10.1111/j.1600-0854.2006.00387.x。

作者

西尔维娅·维拉焦雷吉¹, 玫瑰Puertollano

附属

¹美国国立卫生研究院国家心肺血液研究所细胞生物学实验室，马里兰州贝塞斯达，邮编20892。

PMID： 16497227
预防性维修识别码： 413585英镑
内政部： 10.1111/j.1600-0854.2006.00387.x号

摘要

粘蛋白-1基因突变与IV型粘蛋白沉积症有关，这是一种溶酶体储存障碍，以严重的神经和眼科异常为特征。粘蛋白-1是一种膜蛋白，含有六个假定的跨膜结构域，其N端和C端均位于胞浆表面。为了获得有关介导该蛋白向溶酶体转运的排序基序的信息，我们制作了嵌合体，其中粘蛋白-1的N端和C端尾部部分与报告基因融合。在本文中，我们报道了两个单独的双亮氨酸型基序的鉴定，它们共同调节粘蛋白-1向溶酶体的转运。一个二亮氨酸基序位于N端细胞溶质尾并介导直接运输到溶酶体，而另一个二亮氨酸基序则位于C端尾并作为适配器蛋白2依赖的内化基序发挥作用。我们还发现粘蛋白-1的C末端尾部是棕榈糖基化的，这种修饰可能调节内吞效率。最后，二亮氨酸基序的突变消除了溶酶体的积累，并导致粘蛋白-1在细胞表面的重新分布。综上所述，这些结果揭示了有关调节粘蛋白-1贩运的基序的新信息，并表明棕榈酰化在蛋白质分选中的作用。

PubMed免责声明

数字

**图1。粘蛋白-1的C末端尾部包含早期内体定位的排序信息。**
（A）用单独编码Tac的质粒转染HeLa细胞（左图），或将粘蛋白-1的C末端尾部融合到Tac的细胞外和跨膜结构域（右图）制成嵌合体。参见图2A，了解嵌合体的示意图。（B）用编码Tac-MLN-CTail的质粒单独（第一排和第二排）或与Rab5-Q79L-GFP或Rab5-GFP联合（第三排和第四排）转染HeLa细胞。用Tac单克隆抗体固定、渗透和免疫染色转染细胞，然后用Cy3-偶联的驴抗鼠IgG（用于GFP的双重免疫荧光）或Alexa488-偶联的山羊抗鼠Ig G（用于转铁蛋白和Hrs的双重染色）。共聚焦荧光显微镜检查细胞。对于转铁蛋白染色，细胞与罗丹明转铁蛋白在37°C下孵育15分钟。对于Hrs染色，细胞与抗Hrs的多克隆抗体孵育，然后与Alexa555结合的山羊抗兔IgG孵育。将红色和绿色通道中的图像合并，生成每行上的第三张图片；黄色表示重叠定位。比例尺表示10µm。

**图2。位于粘蛋白-1 C末端尾部的二亮氨酸基序介导Tac-MLN-CTail嵌合体的内化。**
（A）假定的排序基序存在于粘蛋白-1的C末端尾部，排序基序突变为丙氨酸。显示Tac的管腔和跨膜（TM）结构域以及黏蛋白-1（Cyt）的C末端尾部。（B）携带指示突变的野生型Tac-MLN-CTail或Tac-MLN-CTail在HeLa细胞中瞬时表达，用Tac胞外区的单克隆抗体在冰上孵育1小时，洗涤后在37°C下内化15分钟。然后固定细胞，使其渗透，用Cy3-偶联的驴抗鼠IgG染色，并用共焦荧光显微镜进行分析。Bar表示10µm。（C） Tac、Tac-MLN-CTail或Tac-MLN-CTail-L的细胞表面水平⁵⁷⁷通过FACS分析L/AA，如*材料和方法*结果表示为在37°C下孵育15分钟后保留在细胞表面的Tac嵌合体的百分比。数值表示四个独立实验的平均值±SD。

**图3。Tac-MLN-CTail的细胞内积依赖于网格蛋白衔接子AP2。**
（A）用靶向控制（非沉默）或AP2复合物µ2亚单位的siRNA转染HeLa细胞。第二轮转染72小时后，对来自对照细胞和siRNA-处理细胞的等量匀浆进行SDS-PAGE，并使用AP2β2亚基或膜联蛋白-II抗体进行免疫印迹（负载对照）。（B）对照和siRNA处理的HeLa细胞在37°C下与罗丹明转铁蛋白孵育15分钟，并通过共焦显微镜进行分析。（C）用非靶向siRNA或抗AP2 siRNA处理的HeLa细胞转染Tac-MLN-Ctail，并通过FACS分析定量质膜上的嵌合体数量。结果表示为37°C下培养15分钟后残留在细胞表面的Tac-MLN-CTail的百分比。数值表示两个独立实验的平均值±SD。（D）用Tac-MLN-CTail和AP2-GFP共同转染HeLa细胞，用Tac胞外区的单克隆抗体在冰上孵育1h，洗涤并在37°C下内化1min。然后固定细胞，使其渗透，用Cy3-偶联的驴抗鼠IgG染色，并用共焦荧光显微镜进行分析。插图显示所示区域的四倍放大。棒材代表10µm。

**图4。三个半胱氨酸残基的棕榈酰化介导GFP-MLN-CTail向膜的募集。**
（A）在乙醇或棕榈酰化抑制剂2-溴代棕榈酸酯（2-BP）或GFP-MLN-CTail-C的存在下，用GFP-MLN-CTail转染HeLa细胞⁵⁶⁵CC/AAA并通过共焦显微镜进行分析。（B）转染的HeLa细胞被分为胞浆（C）和膜组分（M）。存在或不存在2-BP和GFP-MLN-Tail-C时GFP-MLN-CTail的分布⁵⁶⁵使用GFP特异性抗体通过免疫印迹法测定CC/AAA。加载当量体积的胞浆和膜组分。（C）量化从两个独立实验的（B）中平均的相应GFP波段的光密度。（D）用GFP-MLN-CTail或GFP-MLN-CTail-L转染HeLa细胞⁵⁷⁷L/AA并通过共焦显微镜进行分析。棒材代表10µm。

**图5。棕榈酰化对Tac-MLN-CTail内化的影响。**
（A） Tac、Tac-MLN-CTail和Tac-MLN-CTail-C的内部化⁵⁶⁵通过FACS分析CC/AAA，如*材料和方法*结果表示为37°C孵育15分钟后保留在细胞表面的Tac嵌合体的百分比。图中显示了四个独立实验的平均结果。（B）转染MLN-GFP或MLN-GFP-C的HeLa细胞⁵⁶⁵CC/AAA被代谢标记为[^三H] 然后用抗GFP多克隆抗体对棕榈酸进行6 H的裂解、免疫沉淀，进行SDS-PAGE，并使用抗GFP单克隆抗体进行Western blotting分析（左图）或荧光和放射自显影分析（右图）。薄膜在−80°C下暴露15天。箭头对应于全长MLN-GFP融合蛋白单体形式的预测分子量，而星号对应于推定的蛋白水解形式。较高的条带可能对应于MLN-GFP的二聚体和低聚物。

**图6。全长粘蛋白-1含有额外的分选信号，可调节其向溶酶体的转运。**
HeLa细胞单独转染MLN-GFP（第二排和第三排）或与Tac-MLN-CTail（第一排）联合转染。转染后15小时，细胞与100µg/mL环己酰亚胺孵育6小时，以便有效地退出ER，固定、渗透并用所示抗体进行免疫染色。MLN-GFP为绿色；Tac-MLN-Tail、灯-1和CD63为红色；黄色表示共同定位。Bar表示10µm。

**图7。粘蛋白-1的N末端尾部包含运输到溶酶体的分拣信息。**
（A）表达Tac-MLN-NTail（绿色）的HeLa细胞与Alexa555-EGF孵育10分钟，清洗并内化30分钟以装载早期-晚期内体（第一排），或在20µm leupeptin的存在下染色溶酶体（第二排）3小时。第三行显示用100µg/mL环己酰亚胺和20µm leupeptin处理5 h后，HeLa细胞共表达Tac-MLN-NTail和MLN-GFP。有关嵌合体的示意图，请参阅图8B。（B）用Tac-MLN-NTail（第一行）或Tac-MLN-Ctail（第二行）转染HeLa细胞。转染6小时后，在2µg/mL布雷费尔丁A（BFA）存在下将细胞再培养12小时。然后去除BFA，并在没有或存在20µm leupeptin的情况下，将细胞在37°C下培养指定的时间段。细胞固定并渗透，通过间接免疫荧光染色和共聚焦显微镜显示嵌合体的分布。棒材代表10µm。

**图8。位于粘蛋白-1 N末端尾部的二亮氨酸基序的突变导致Tac-MLN-NTail嵌合体误靶向质膜。**
（A）将Tac-MLN-NTail（红色）与Rab5-Q79L-GFP联合转染HeLa细胞。在细胞固定前4 h加入亮肽（20µm），通过间接免疫荧光染色和共聚焦显微镜显示嵌合体的分布。（B）表达野生型Tac-MLN-NTail或在二亮氨酸基序（Tac-MLN-NTail-L）携带丙氨酸突变的Tac-MLN-NTail的HeLa细胞¹⁵通过间接免疫荧光染色和共焦显微镜分析L/AA）。粘蛋白-1的野生型和突变NTail序列和双亮氨酸基序的位置显示在面板上方。棒材代表10µm。

**图9。两个双亮氨酸基序都是粘蛋白-1靶向溶酶体所必需的。**
（A）携带指示突变的野生型MLN-GFP或MLN-GFP在HeLa细胞中瞬时表达。转染最后6小时加入环己酰亚胺；然后固定细胞并通过共聚焦显微镜进行分析。（B）野生型粘蛋白或指示的粘蛋白突变体与红色荧光蛋白DsRed-Monomer（RFP）融合，并与Rab5-Q79L-GFP共表达。转染后15小时，用环己酰亚胺处理细胞6小时，并用共焦显微镜进行分析。棒材代表10µm。

**图10。粘蛋白-1的拟议拓扑示意图。**
粘蛋白-1具有六个预测的跨膜结构域，N端和C端的尾部位于细胞质中。瞬时受体电位通道域为绿色。本研究中确定的排序图案用蓝色表示。蛋白质被描述为棕榈酰化，并与C末端棕榈酰化位点的膜相关。

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