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.2006年3月；80(5):2267-79.
doi:10.1128/JVI.80.5.2267-2279.2006。

单次鼻内接种副粘病毒载体疫苗可保护豚鼠免受致命剂量埃博拉病毒的攻击

亚历山大·布克雷耶夫 1, 杨丽娟, 谢里夫·扎基, Wun-Ju Shieh先生, 皮埃尔·罗林, 布莱恩·墨菲, 彼得·柯林斯, 安东尼·桑切斯
附属公司

用副粘病毒载体疫苗单次鼻内接种可保护豚鼠免受致命剂量的埃博拉病毒攻击

亚历山大·布克雷耶夫等。 J维罗尔. 2006年3月.

摘要

为了确定鼻内接种副粘病毒载体疫苗是否能诱导对埃博拉病毒（EV）的保护性免疫，对重组人副流感病毒3型（HPIV3）进行了修饰，以单独表达EV结构糖蛋白（GP）（HPIV3/EboGP）或与EV核蛋白（NP）一起表达（HPIV2/EboGP-NP）。通过这些重组病毒表达EV-GP，可将其有效地并入病毒颗粒，并增加Vero细胞的细胞病变效应。EV抗体中和HPIV3/EboGP的效率是HPIV3抗体的100倍。单次鼻腔接种10（5.3）PFU HPIV3/EboGP或HPIV3/EboGP-NP的豚鼠没有明显的疾病迹象，但对EV蛋白产生了强烈的体液反应。当这些动物接受腹腔注射10（3）PFU EV的攻击时，没有任何疾病的外在迹象，血液中没有病毒血症或可检测到的EV抗原，脾脏、肝脏和肺部也没有感染的迹象。相反，所有对照动物在受到攻击后死亡或发展成严重的EV疾病。单剂量疫苗获得的高效免疫表明，以重组呼吸道病毒为基础的活载体疫苗进行鼻内免疫可能是诱导对严重全身感染（如出血热制剂引起的感染）产生保护性反应的有利方法。

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数字

图1。
图1。
表达EV GP和NP的重组HPIV3的基因组结构。（A）HPIV3载体的基因组示意图，插入位点用箭头表示（顶部），HPIV3向量包含编码EV GP（中间）的转录盒或编码GP和NP的两个单独盒（底部）。每个结构的基因组长度（以核苷酸表示）显示在右侧。（B） HPIV3基因组中EV-GP（顶部）和NP（底部）ORF侧翼的序列，以抗原或阳性意义显示。指示了GP和NP插入件的边界。HPIV3特异性基因起始和基因终止转录信号被装箱，三核苷酸长的基因间序列被命名为IG，GP和NP ORF的起始和终止密码子用黑体表示，每个ORF的其余部分用三个点表示。用于克隆的限制性内切酶位点在其下划线序列下方指示。
图2。
图2。
在恢复的HPIV3/EboGP和HPIV3/EboGP-NP病毒的EV-GP ORF编辑位点检测到偶然突变。顶行显示了EV-GP mRNA未编辑版本中部分编辑位点的阳性序列，其中显示了编码氨基酸（a.a.）及其在GP中的序列位置，并在同寡聚体a区下划线。下一行显示了包含八个a残基的mRNA的编辑版本；这是最初插入HPIV3载体但被证明不稳定的版本。接下来的四行显示了从含有核苷酸替换或核苷酸缺失的恢复病毒中提取的序列，这些核苷酸替换或缺失破坏了八个a残基的序列。底部的序列是编辑过的信使核糖核酸的工程突变版本，包含两个A→G取代，中断八个A残基的运行，而不影响氨基酸编码；该版本用于制造本研究中使用的第二组HPIV3/EboGP和HPIV3/EboGP-NP病毒。
图3。
图3。
重组载体表达的细胞相关EV-GP和NP的Western blot分析。用重组病毒感染LLC-MK2细胞，24 h后制备总细胞裂解物，在变性和还原条件下，在4~12%双三元丙烯酰胺梯度凝胶上电泳分离，并进行Western blot分析。用兔抗EV抗体（A）、豚鼠抗NP抗体（B）和鼠抗肌动蛋白单克隆抗体作为负荷对照（C）分析复制印迹。车道：1、分子量标记；2、HPIV3；3、HPIV3/EboGP；4、HPIV3/EboGP-NP；模拟感染。标记蛋白的分子量（单位为千道尔顿）显示在左侧边缘，EV GP1（A）和NP（B）的位置用箭头表示。
图4。
图4。
将EV GP1和GP2并入重组病毒颗粒。纯化的HPIV3和HPIV3/EboGP通过不连续蔗糖梯度沉淀制备，在变性和还原条件下，在4~12%（顶面板A和B）或10%（底面板A）双三元丙烯酰胺梯度凝胶上通过电泳分离，并使用针对灭活纯化EV病毒培养的豚鼠抗GP抗体（顶面板A）或兔超免疫血清（底面板A）进行Western blot分析。通过银过滤（B）分析含有相同样品阵列的第二个凝胶。车道：1、分子量标记；2、HPIV3；3、HPIV3/EboGP。标记蛋白的分子量（单位为千道尔顿）显示在左侧边缘，EV GP1、GP2和主要HPIV3蛋白的位置显示在右侧边缘。
图5：。
图5：。
病毒颗粒的电子显微镜。所示为HPIV3（A）、HPIV3/Ebo GP（B）、HPIV3/Ebo GP NP（C）和EV（D）的阴性染色图像。糖蛋白蛋白胨沿着所有病毒颗粒的外缘被视为条纹，并且在图B中明显可见核衣壳挤出。显示了代表性图像；一般来说，HPIV3及其带有EV基因插入的衍生物之间的一致性差异并不明显。
图6。
图6。
在LLC-MK2和Vero细胞培养物中感染后第3天，所示重组病毒产生的CPE。感染是在每细胞0.2个PFU的输入MOI下进行的。感染HPIV3/EboGP-NP产生的CPE与感染HPIV3/4EboGP的CPE没有区别，因此未显示。
图7。
图7。
所述重组病毒在LLC-MK2和Vero细胞中的多步生长动力学。细胞单层以每细胞0.001 PFU的输入MOI感染所示病毒。每隔24小时采集上清液并进行快速冷冻，在LLC-MK2细胞中测定病毒滴度，并以每毫升PFU表示。显示了三份样品的平均值和标准误差。这些数据来自总共两个独立实验中的一个代表性实验。
图8。
图8。
在初始免疫感染（A）和第28天EV攻击（B）后，接受所示重组病毒的实验组豚鼠的平均体重。平均重量绘制为相对于免疫日（A）或激发日（B）平均重量的百分比。对照组（接种HPIV3疫苗）的五只动物在挑战后第7天没有被处死，其中两只动物在第8天死亡，一只在第9天死亡，两只在第10天死亡。
图9：。
图9：。
初始免疫后豚鼠血清抗体的特异性。以下样品在三个7.5%重复的SDS-聚丙烯酰胺凝胶中分离：来自未感染细胞的模拟纯化病毒（车道1）、纯化的HPIV3（车道2）、纯化HPIV3/EboGP（车道3）、纯化HPIV3/GP-NP（车道4）和纯化的EV（车道5）。一个复制凝胶用考马斯蓝（A）染色，另两个用HPIV3（B）或HPIV3/EboGP-NP（C）免疫后第28天采集的具有代表性的豚鼠个体抗血清进行Western blot分析。在面板A和C中，EV GP1和NP的位置分别由星星和圆圈表示。面板A第5车道中GP1的检测不良可能反映了糖蛋白与考马斯染色的低反应性，因为碳水化合物侧链密度高。面板C的车道4中缺少NP，这表明EV NP未纳入HPIV3矢量粒子。
图10。
图10。
激发后第7天检测豚鼠内脏EV抗原。所示为用HPIV3（A、B和C）免疫的对照动物和用HPIV3/EboGP-NP（D、E和F）免疫的动物的脾（A和D）、肝（B和E）和肺（C和F）组织的IHC染色的代表性示例。含有EV抗原的部分区域被染成红色。Bar，100μm。
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