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.2006年3月3日；98(4):490-8.
doi:10.1161/01.RES.0000205846.46812.be。 Epub 2006年1月26日。

内皮脂肪酶水解高密度脂蛋白激活PPARalpha：高密度脂蛋白质介导的白细胞粘附抑制的候选机制

瓦利德·艾哈迈德 1, 加布里埃拉·奥拉萨努, 维迪卡·尼赫拉, Liana Asatryan公司, 丹尼尔·雷德, 欧利亚娜·齐乌岑科娃, 豪尔赫·普卢茨基
附属公司

内皮脂肪酶水解高密度脂蛋白激活PPARalpha：高密度脂蛋白质介导的白细胞粘附抑制的候选机制

瓦利德·艾哈迈德等。 循环研究. .

摘要

虽然已知高密度脂蛋白（HDL）可抑制内皮粘附分子的表达，但这种抗炎作用的机制尚不清楚。令人惊讶的是，我们观察到，在脂肪酶抑制剂四氢利普抑素的存在下，HDL不再降低U937单核细胞对肿瘤坏死因子（TNF）α刺激的人内皮细胞（EC）的粘附。考虑到这种作用的内皮机制，我们发现内皮脂肪酶（EL）在EC和非EL-表达的NIH/3T3小鼠胚胎成纤维细胞中的过度表达显著降低了TNFalpha诱导的VCAM1表达和启动子活性，其方式取决于HDL浓度和完整的EL活性。鉴于过氧化物酶体增殖物激活受体（PPAR）（与代谢、动脉粥样硬化和炎症相关的核受体）的脂解激活，我们假设EL水解HDL是PPAR激活的内源性内皮机制。在转染EL-的NIH细胞和牛EC中，HDL显著增加了PPAR配体结合域的激活，激活顺序为PPAR-α>>-γ>-δ。此外，HDL刺激以PPARalpha依赖的方式诱导EC中典型PPARalphi靶基因酰基辅酶a氧化酶（ACO）的表达。EL-腺病毒转染细胞的条件培养基（而非接触HDL的对照培养基）也激活PPARalpha。EL对PPARalpha的激活作用以HDL为底物时最强，对LDL和VLDL的影响较小。最后，HDL抑制白细胞与从野生型但不含PPARalpha缺陷小鼠分离的TNFalpha刺激内皮细胞的粘附。该数据确立了EL水解HDL作为PPARalpha激活的一种新的独特自然途径，并确定了HDL介导的VCAM1表达抑制的潜在机制，对炎症和血管生物学中的EL和PPAR都具有重要意义。

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数字

图1
图1
HDL抑制U937单核细胞与TNFα刺激的内皮细胞的粘附，但在存在脂肪酶抑制剂四氢利普抑素的情况下不存在。A、 使用PPARα激动剂WY14643（10µmol/L）、HDL（90µg/mL）或HDL（九十µg/mL）在脂肪酶抑制剂四氢利普抑素（十µmol/L）存在下预处理后，将荧光标记的U937细胞添加到TNFα刺激的（五十ng/mL）人EC单层中。荧光显微镜显示在接近汇合的EC层上有粘附的U937细胞（绿色）。B、 通过荧光分析测定EC单层上U937粘附的定量。结果以与TNFα刺激细胞结合的白细胞百分比表示。条形代表平均值±SEM（n=3）#P（P）与对照组相比，<0.01 TNFα刺激的内皮细胞*P（P）<0.01 WY和HDL与TNFα刺激的内皮细胞。
图2
图2
EL/HDL抑制TNFα介导的VCAM1 mRNA表达和启动子活性。A、 在TNFα（20 ng/mL，16小时）刺激前，对转染EL的人EC（HUVEC）进行VCAM1 mRNA表达的Northern分析，然后用增加HDL浓度（µg/mL，3小时）进行预处理。在这些EL转染的细胞中，高密度脂蛋白降低了TNFα诱导的VCAM1的表达，但在脂肪酶抑制剂四氢lipstatin（10µmol/L）存在的情况下没有降低。B、 在存在（实线）或不存在（虚线）EL转染的情况下，在高密度脂蛋白浓度范围内的NIH细胞中测试TNFα介导的VCAM1启动子激活。用HDL预处理细胞（3小时），然后用TNFα刺激细胞（30 ng/mL，12小时），再进行启动子核糖核酸酶分析。在EL转染的情况下，HDL显著抑制VCAM1启动子激活63%，而在EL未转染的细胞中为17%(*P（P）200µg/mL HDL时<0.05；n=3，一式三份）。相比之下，合成的PPARα激动剂WY14643（250µmol/L）将TNFα诱导的VCAM1启动子活性从5.3倍抑制到1.7倍；在存在脂肪酶抑制剂四氢利普抑素（10µmol/L，数据未显示）的情况下，EL/HDL对VCAM1启动子没有影响。
图3
图3
EL优先水解HDL，以依赖EL催化的方式激活PPARα。方法中所述的标准PPARα-LBD-GAL4测定在有或没有共转染人EL的BAEC中进行。结果表示为标准化后对照的倍数激活。A、 EL优先作用于磷脂酰胆碱（PC）和HDL以激活PPARα-LBD。用空载体或EL构建物转染的EC暴露于所示浓度的PC、LDL、VLDL和HDL，并测定PPARα-LBD活性。在EL-转染细胞中，高密度脂蛋白的活性最强(*P（P）<0.05); LDL和VLDL（所有脂蛋白均为60µg蛋白/mL）也表现出更适度的活化。为了进行比较，显示了PPARα-LBD对WY14643（10µmol/L）的响应。B、 在未转染的BAEC中，HDL以浓度依赖的方式增加PPARα-LBD的激活，但在四氢利普抑素（10µmol/L）的存在下不增加。C、 四氢利普抑素预培养（30分钟，室温）以浓度依赖性的方式降低PPARα-LBD的激活，这在暴露于HDL（60µg/mL）的对照转染（未显示）和EL-转染BAEC中很明显。D、 EL/HDL激活PPARα需要催化活性的EL。在HDL浓度增加的情况下，转染野生型或催化非活性的EL点突变后，在BAEC中进行PPARα–LBD-GAL4分析。在表达催化非活性EL突变的细胞中，在所测试的HDL浓度范围内，PPARα-LBD激活在基础水平以上没有显著增加。为了进行比较，显示了野生型EL转染细胞中伴随的PPARα-LBD激活；四氢利铂（10µmol/L）消除了EL/HDL/PPARα反应。
图4
图4
异源EL表达导致PPARα激活以响应HDL。与之前一样，在已知缺乏内源性EL表达的NIH细胞中进行标准PPARα–LBD-GAL4分析。A、 在测定PPARα-LBD活化之前，将转染EL或空载体的NIH细胞暴露于不断增加的HDL浓度下。HDL以浓度依赖的方式激活PPARα–LBD，但仅在EL转染细胞中激活。B、 在暴露于HDL（100µg/mL）和增加EL蛋白条件培养基（如方法中所述从EL腺病毒表达细胞制备和定量）或对照转染培养基（50µL/孔至500µL/-孔培养基，24孔板）的NIH细胞中进行PPARα-LBD分析。PPARα-LBD的激活程度与EL-调节培养基的添加量呈线性关系；对照培养基无影响。
图5
图5
高密度脂蛋白（HDL）经EL水解后，PPAR异构体的活化顺序为-α>-γ>δ。与之前一样，在NIH细胞中使用LBD分析测试了在HDL浓度增加的情况下，对EL表达的每个PPAR-LBD同型（α、γ或δ）的激活。EL/HDL最有效地激活PPARα，其次是PPARγ，然后是PPARδ，在测试的最大HDL浓度下（90µg/mL）。EL/HDL反应表示为已知PPAR等型特异性配体的PPAR–LBD活化百分比，如下所示：PPARα-WY14643（10µmol/L）；PPARγ-BRL49653（1µmol/L）；PPARδ-苯扎贝特（10µmol/L）。
图6
图6
EL/HDL诱导PPARα靶基因酰基辅酶A氧化酶（ACO）的mRNA表达，但仅在PPARα的遗传存在下。在对ACO进行Northern blot分析之前，用EL或对照质粒转染PPARα野生型（+/+）和缺陷型（−/-）小鼠的EC，并用WY14643（10µmol/L）或HDL（90或200µg/mL）刺激。与GAPDH表达相比，密度测定和定量分析表明，在EL-转染细胞中，WY和HDL分别使ACO增加1.92倍和2.47倍。
图7
图7
EL和LPL是脂溶性PPARα活化的不同机制。在BAEC中比较了ELvs LPL对VLDL或HDL的额外PPARα-LBD激活。A、 细胞暴露于不断增加的LPL浓度，如在固定浓度的极低密度脂蛋白（5µg/mL）存在下所示。如前所述，LPL以浓度依赖性方式增加PPARα激活。EL-转染的存在与否对LPL/VLDL观察到的PPAR激活没有影响。B、 重复（A）中的类似实验，增加LPL浓度，但存在固定浓度的HDL（90µg/mL）。以HDL为底物，EL过度表达显著增加了在任何给定LPL浓度下的PPARα激活(P（P）<0.05（每种LPL浓度）。
图8
图8
HDL以PPARα依赖的方式抑制白细胞与TNFα刺激的小鼠内皮细胞的粘附。A、 荧光素标记的小鼠J774A.1小鼠单核巨噬细胞样细胞被添加到TNFα刺激的（30 ng/mL）小鼠PPARα+/+和PPARα−/−在存在脂肪酶抑制剂四氢利普抑素（10µmol/L）的情况下，用PPARα激动剂WY14643（10μmol/L。荧光显微镜显示黏附在小鼠EC层上的J774A.1细胞（绿色）。B、 荧光法测定小鼠EC单层上J774A.1粘附的定量。结果以与TNFα刺激细胞结合的白细胞百分比表示。条形代表平均值±SD（n=3）#P（P）<0.05（TNFα单独刺激与TNFα未刺激对照EC）**P（P）<0.01（TNFα刺激+/+vs−/−EC）*P（P）<0.05（TNFα和WY或HDL与TNFα单独刺激+/+EC）；†P（P）<0.02（非模拟+/+vs−/−EC）。
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