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.2006年1月；116(1):36-48.
doi:10.1172/JCI26505。

控制SRF与CArG盒染色质结合调节平滑肌基因表达

奥利弗·G·麦克唐纳 1, 布莱恩·瓦姆霍夫, 马克·霍夫纳格尔, 加里·欧文斯
附属公司

控制SRF与CArG盒染色质结合调节平滑肌基因表达

奥利弗·G·麦克唐纳等。 临床研究杂志. 2006年1月.

摘要

SMC转录的精确控制在血管发育和病理生理学中起着重要作用。血清反应因子（SRF）通过与显示SMC限制表达的基因中的CArG盒DNA序列结合来控制SMC基因转录。然而，在这些基因的天然染色质中，调节SRF与CArG盒DNA结合的机制尚不清楚。在这里，我们报告了SRF与小鼠SMC基因CArG盒染色质的SMC限制性结合与该染色质内的翻译后组蛋白修饰模式有关，该染色质在培养和体内对SMC谱系具有特异性，包括组蛋白H3和H4残基的甲基化和乙酰化。我们发现，在激活SMC基因表达的过程中，前肌生成性SRF辅活化因子心肌蛋白增加了SRF与甲基化组蛋白和CArG盒染色质的关联。相反，肌源性抑制因子Kruppel-like factor 4向SMC基因募集组蛋白H4脱乙酰酶活性，并在抑制SMC基因表达期间阻断SRF与甲基化组蛋白和CArG盒染色质的关联。最后，我们观察到组蛋白H4的脱乙酰化，以及血管损伤抑制SMC分化过程中SRF结合的丢失。综上所述，这些发现提供了新的证据，证明SMC选择性表观遗传控制SRF与染色质结合在体内对病理生理刺激的反应中对SMC基因表达的调节起着关键作用。

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数字

图1
图1。细胞特异性组蛋白修饰与SRF与α的细胞选择性结合相关-座椅模块组件和SM-MHC公司.
(A类)SRF富集的定量ChIP分析α的5′-CArG盒-座椅模块组件,SM-MHC公司、和c-fos公司来自染色质从大鼠主动脉平滑肌细胞和内皮细胞分离。(B类)分离的染色质通过微球菌将SMC和EC消化成单核体片段（S7）核酸酶。DNA被纯化并用侧翼的引物扩增α的5′-CArG盒-座椅模块组件,SM-MHC公司、和c-fos公司. TheEC特异基因的5′-启动子区VEC公司也包含在控件中。这个VEC公司发起人不包含CArG框。有关说明，请参见方法。(C类)染色质从大鼠主动脉和血液中分离，并通过ChIP as测定SRF结合在里面A类. (天)组蛋白修饰在α-座椅模块组件,向量,心肌肌球蛋白重链（心肌特异性；厘米α-MHC公司)、和c-fos公司ChIP在培养的ES细胞（ESC）中的启动子，SMC和EC。我们观察到的模式类似于α-座椅模块组件在SM-MHC公司（数据不是如图所示）。图1和图1的所有ChIP数据其他图绘制为等量的褶皱富集输入DNA，并缩放图1D在每个水平面板上相等（即每次修改），以便不同启动子之间的富集度可以进行比较。*P（P）<0.05，由学生测量t吨测试。仅使用珠子和不使用抗体的对照实时PCR扩增的DNA始终未能免疫沉淀（数据未显示；参见补充图2）实验。H3K79dMe，H3 Lys79二甲基化；H3K9Ac，H3 Lys9乙酰化。
图4
图4。KLF4促进SRF结合和H4Ac在α-座椅模块组件和SM-MHC公司.
(A类)SMC感染CMV-KLF4（KLF4）或CMV-empty通过ChIP测量腺病毒和SRF、H4Ac和H3K4dMe。*P（P）<0.05（学生）t吨测试。微球菌核酸酶消化的可及性如图1B所示进行测量。(B类)培养的SMC感染了等量的CMV-empty、CMV-mycardin或CMV-mycordin与CMV-KLF4（myo+KLF4）如上所述，通过ChIP测量腺病毒和SRF与CArG盒的结合。(C类,天、和F类)ChIP和实时RT-PCR是从感染相应的含有TSA的腺病毒以1 ng/ml或5 ng/ml的速度溶于DMSO或DMSO只有*P（P）与相比，样本<0.05学生CMV清空控制单元t吨测试。(电子)SRF是从感染了CMV-KLF4或对照（CMV）病毒和免疫沉淀物H3K4dMe和SRF的蛋白质印迹（IP和IP控制）。
图3
图3。有助于肌钙蛋白/SRF与CArG盒结合的识别修改。
(A类) α-座椅模块组件转基因是稳定的通过整合酶系统转染大鼠主动脉平滑肌细胞，如方法，并使用针对转基因和内源性基因*P（P）<0.05 by学生的t吨测试。(B类)SMC是感染携带巨细胞病毒心肌蛋白（Myo）或巨细胞病毒空载体（CMV）的腺病毒表达载体，并对SRF、H4Ac和H3K4dMe进行ChIP。(C类)SMC被腺病毒感染B类Elk-1、SRF和FLAG-心肌免疫沉淀物对H3K4dMe和SRF进行Western blotting。非免疫IgG抗血清未能从SMC提取物中免疫沉淀SRF和H3K4dMe所有其他蛋白质IP实验（未显示数据和补充图2）。(天)SMC与年一样受到感染B类和SRF免疫沉淀物进行H3K4dMe和SRF的Western印迹。(电子)SMC被表达siRNAs的腺病毒感染肌钙蛋白（siMyo）或GFP（siGFP；对照）。染色质被分离，并且ChIP测量了SRF与5′-CArG盒的结合水平。(F类)SMC与年一样受到感染电子、和核能提取物按天. (G公司)肽结合如方法中所述，用FLAG肌苷进行测定。肌钙蛋白标记从SMC提取物中收集的免疫沉淀物含有相应的生物素化肽使用Western blottingHRP-链霉亲和素。H3unmod，未修饰的H3肽。(小时)肌卡蛋白肽结合试验G公司，比较肌苷免疫沉淀2μg二甲基化H3肽在Lys4（H3K4dMe），在Lys9（H3K9dMe丝氨酸10磷酸化（H3S10P）。
图2
图2。转录因子和组蛋白修饰在α-座椅模块组件启动子增强子位点。
在ChIP中使用了15对以400-bp间隔排列的PCR引物绘制因子分布图的分析。核酸酶可及性如图1所示确定。E盒是5′到CArG框的顺元素。数据代表2独立实验。
图5
图5。Myocardin和KLF4对体内转基因小鼠肝脏中SMC基因的表达产生相反的影响。
(A类)从感染小鼠肝脏中提取mRNACMV-empty control virus，CMV-KLF4，CMV-mycardin，或与肌卡蛋白和KLF4病毒。心肌蛋白和KLF4的表达水平为通过实时PCR检测，证明这些基因的传递成功。数据归一化为18S表达水平。(B类)LacZ染色SM-MHC公司-LacZ–注射的转基因小鼠A类。对于中的每个面板B类，左上方的图像显示心脏在冠状动脉中表达SMC特异性LacZ染色（ca），右上角的图片显示了这些老鼠的横截面在主动脉中膜（m）显示SMC特异性LacZ染色。这个标记内皮层（e）和外膜（adv）。媒体展览镶嵌染色，这是典型的SM-MHC公司–转基因小鼠。中的底部图像每个面板显示小鼠肝脏中存在LacZ的染色。(C类)αmRNA水平-座椅模块组件和SM-MHC公司通过实时RT-PCR和SRF测量通过ChIP测定肝脏中这些基因与CArG盒染色质的结合注射了相应腺病毒的小鼠。
图6
图6。Myocardin和KLF4对培养内皮细胞中SRF与SMC基因的结合产生相反的影响。
(A类)感染巨细胞病毒心肌蛋白或对照组的内皮细胞形态学（CMV空）腺病毒。(B类)SRF绑定到的ChIP结果感染EC的指示基因的5′-CArG盒CMV-心肌腺病毒或控制病毒。(C类)ChIP如中所示B类在仅感染巨细胞病毒心肌蛋白的EC中，对照组或内皮细胞与CMV-心肌蛋白和CMV-KLF4病毒共感染*P（P）<0.05（按学生）t吨测试。
图7
图7。在SMC表型转换过程中，SRF与CArG盒染色质的结合被破坏。
(A类)左：心肌蛋白和KLF4的表达对PDGF-BB（BB）处理培养的SMC 24小时（24hBB）或载体治疗24小时（24hVeh）。右：使用PDGF-BB 72小时（72hBB）或用PDGF-BB培养基处理24小时的细胞小时，然后用车辆介质替换PDGF-BB介质培养48小时（24hBB48hVeh）。数据标准化为18秒。如前所述进行PDGF-BB治疗（8）。(B类)SMC接受治疗使用载体（Veh）或PDGF-BB 24小时，SRF免疫沉淀物对H3K4dMe或SRF（IP控制）进行Western blotting。(C类)SMC用PDGF-BB处理，如A类，mRNA通过RT-PCR测量A类（顶部面板），ChIP为在5′-CArG区域执行，其中指示的基因用于指示的参数（SRF绑定等）。(天)大鼠方法中描述的球囊导管和mRNA或染色质损伤分别通过实时RT-PCR和ChIP进行分离和分析。这个顶部面板是未受损对照主动脉（Sham）的组织学显示主动脉受伤（受伤），表明球囊导管受伤如图所示，采用的技术成功地损伤了船只损伤后14天出现新生内膜（NI）。M表示位置血管介质的变化。对于mRNA和ChIP（底部面板），血管伤后24小时或72小时收获，并与对照组进行比较船只。
图8
图8。SRF与CArG盒染色质结合的表观遗传调控模型。
灰色方块代表组蛋白八聚体，周围包裹着红色DNA链他们。带有Me（甲基）和Ac（乙酰基）的暗线从H3和H4突出的组蛋白尾部结构域H4和H3乙酰化和H3 Lys4甲基化。在这个模型中血管损伤抑制心肌蛋白和/或招募KLF4依赖性HDACSMC基因启动子的活性导致SRF结合和这些基因的转录抑制，以促进去分化表型。相反，在没有KLF4的情况下，SRF能够识别“打开”中可访问的CArG盒序列含有H4Ac的染色质，协同心肌蛋白与H3K4dMe的对接，促进SRF与染色质的结合和转录激活促进SMC差异化。蓝色蛋白质标记“？？”表示假定的心肌病附件可能协助心肌蛋白与CArG附近甲基化组蛋白对接的因子DNA序列，以帮助束缚和/或稳定SRF与SMC基因的结合染色质，在SMC中富含H3K4dMe。
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