Functional expression of Kir4.1 channels in spinal cord astrocytes

doi:10.1002/glia.20312

.2006年4月1日；53(5):516-28.

doi:10.1002/glia.20312。

脊髓星形胶质细胞中Kir4.1通道的功能表达

M L奥尔森¹, 东本H, S L坎贝尔, J J哈布利茨, H Sontheimer公司

附属公司

PMID： 16369934
预防性维修识别码： PMC2553202型
内政部： 10.1002/glia.20312年

脊髓星形胶质细胞中Kir4.1通道的功能表达

M L奥尔森等。格利亚. 2006.

.2006年4月1日；53(5):516-28.

doi:10.1002/glia.20312。

作者

M L奥尔森¹, H东岛, S L坎贝尔, J J哈布利茨, H Sontheimer公司

附属

¹美国阿拉巴马州伯明翰市阿拉巴马大学伯明翰分校神经生物学和公民国际研究中心系，邮编35294。

PMID： 16369934
预防性维修识别码： PMC2553202型
内政部： 10.1002/glia.20312年

摘要

脊髓星形胶质细胞（SCA）对K+具有高渗透性，因此具有超极化静息膜电位。据信，潜在的K+通道参与神经释放的K+的摄取。这些K+通道在生物物理学和药理学方面已被广泛研究，但其在脊髓中的分子特性目前尚不清楚。使用多种方法的组合，我们证明由Kir4.1亚单位组成的通道负责调节SCA中静止的K+电导。生物物理分析表明，星形细胞Kir电流具有弱整流性，通过增加[K+]o而增强，并被微量Ba2+浓度所抑制。这些电流对选择性阻断Kir6.x通道的甲苯丁烯胺和阻断Kir1.1和Kir3.1/3.4通道的特硫平不敏感。PCR和Western blot分析表明Kir4.1在SCA中显著表达，免疫细胞化学显示Kir4.1通道定位于质膜。Kir4.1蛋白水平显示体内发育上调，与同期记录的电流增加平行。Kir4.1在体内脊髓灰质的大部分区域都有高表达，脊髓切片记录显示Kir电流显著。比较野生型小鼠和纯合型Kir4.1基因敲除小鼠SCA的电生理记录证实，基因敲除鼠中完全和选择性地缺乏Kir通道，这表明Kir4.1是SCA在体外和原位调节静息钾电导的主要通道。

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数字

图1
K（K）_红外电流有助于SCA的静息电导。答：5 mM[K中的典型电压阶跃响应（插图中描述的协议）⁺]_哦（顶部），20 mM[K⁺]_哦.（中间）和5 mM[K⁺]_哦+100μM巴²⁺（底部）。**B类：**SCA中的小电压阶跃（-80至-40 mV，～5 Hz）会引发强大的电流，该电流在20 mM和50 mM细胞外钾（[K⁺]_哦)并被Ba抑制²⁺应用程序。保持电流也发生了变化，增加了[K⁺]_哦，当返回到控制条件时，两者都返回到基线。**抄送：**电流振幅在50 mM[K范围内增加到控制的近五倍⁺]_哦，而每个[K的电流>90%⁺]_哦Ba抑制浓度²⁺（n=5）。**医生：**在镀液中加入钡后，输入电阻显著增加²⁺从24.2±7.9 mΩ的平均值到549.5±116.6 mΩ（n=4）。**电子邮箱：**电流钳实验表明Ba的应用²⁺SCA去极化约20 mV（n=10，插图显示了一个典型示例）。

图2
SCA中的逆转录聚合酶链反应（RT-PCR）实验表明，所有K_红外基因检测。第一道和最后一道凝胶为100-bp标记，第二道和第三道为阴性对照，水替代mRNA，下一道无反转录反应。对于所有阴性对照*Kcnj10公司*使用引物。在随后的每条路线中，首先在SCA（>9 DIC）中使用指定基因的引物，然后使用大鼠大脑cDNA文库作为阳性对照。低检测水平*Kcnj1公司*在大鼠大脑中，促使我们测试大鼠肾脏（KID）cDNA文库。表1总结了每种产品的引物对和预期分子量。

图3
K（K）_红外SCA中的通道呈弱整流。答：SCA（8 DIC）中线性电压斜坡（插图中描述的协议）引发的典型电流响应表明，Ba²⁺抑制反转电位周围正负电位处的显著电流。减去的钡敏感电流是弱整流（底部）。**B类：**相反，巴²⁺仅向内抑制K_红外小胶质细胞（MGC，8DIC）中的电流，表明这些细胞具有强烈的整流性。减去的钡敏感电流为强整流电流（B，底部）。

图4
K（K）_红外SCA中的电流对甲苯磺丁脲和三硫平不敏感。答：托布他胺治疗前后的典型电压阶跃和平均值数据（峰值电流密度为-140 mV）（分别为100μM，103.0±16.0 pA/pF至96.7±16.2 pA/pF，n=6）表明SCA对托布他脲不敏感。**B类：**类似地，三硫平。（10 nM）对K的影响很小_红外来自SCA的电流（n=6）。

图5
K（K）_红外4.1蛋白质在培养的SCA中表达。答：培养脊髓（SC）和皮质（CTX）星形胶质细胞（9DIC）的蛋白质印迹显示。HEK细胞作为阴性对照。以肌动蛋白作为负荷控制，剥离并重新保护该印迹。～50和200 kD的频带代表K_红外4.1单体和四聚体。**B类：**免疫细胞化学显示K的表面定位_红外4.1培养SCA。抗GFAP用于共同标记和指示星形胶质细胞。底部的彩色图像是合并的K_红外4.1（绿色）和GFAP（红色）图像。DAPI染色为蓝色。比例尺=20μm。

图6
K（K）_红外4.1 shRNAs击倒脊髓星形胶质细胞内向整流电流。答：来自pZOFF EGFP（1，黑色）和pK的代表性电压斜坡_红外4.1-OFF EGFP（2，灰色）转染显示。**B类：**模拟和pK的平均电流密度数据_红外4.1-OFF EGFP转染细胞的电流振幅（-140 mV时的峰值电流，模拟n=13，K_红外4.1shRNA，n=11，对< 0.05).抄送：总结pZOFF EGFP和pK静息膜电位的条形图_红外4.1-OFF EGFP转染细胞。模拟n=13，K_红外4.1shRNA，n=11，对< 0.05). D：此条形图表示pZOFF EGFP和pK中输入电阻值的汇总数据_红外4.1-OFF EGFP转染细胞（模拟n=13，K_红外4.1shRNA，n=11，对< 0.05).

图7
在建立K的星形细胞培养物之前，对小白蚁进行了基因分型_红外4.1蛋白质分析。答：用尾部剪刀PCR对小鼠进行基因分型，以区分野生型、杂合型和K型_红外4.1淘汰动物。从左到右，100bp的DNA阶梯，两个K_红外4.1基因敲除动物（-/-等位基因有383-bp带）、野生型（WT）（+/+等位基因只有634bp）、杂合型（+/-等位蛋白有两条带）和最后一条通道，小鼠基因组DNA缺失（无带）。**B类：**对照组和敲除组动物培养星形胶质细胞的Western blot显示K_红外4.1表达。**车道1**WT培养的皮层星形胶质细胞；**车道2**，杂合培养的皮质星形胶质细胞；**3、4车道**，培养的2只敲除动物皮层星形胶质细胞；**车道5**，大鼠脊髓裂解物用作阳性对照。将该印迹剥离并用肌动蛋白作为负载对照进行再处理。

图8
脊髓向内矫正K_红外K中没有电流_红外4.1敲除小鼠。答：显示由野生型（+/+）和K的线性电压放大器引发的全细胞电流的典型示例的轨迹_红外4.1（-/-）敲除小鼠。**B类：**显示施加Ba前后代表性电压步骤的痕迹²⁺（100μM）。**抄送：**表示电流密度汇总数据的条形图。pA/pF）。野生型（WT），n=14；KO n=14，对< 0.05).医生：表示野生型和K中平均静息膜电位值的条形图_红外4.1敲除小鼠（WT，n=15；KO，n=15，对< 0.05).电子邮箱：条形图表示野生型和K中输入电阻值的汇总数据_红外4.1敲除小鼠（WT，n=14；KO，n=14，对< 0.05).

图9
大鼠脊髓的Western blot显示K的发育上调_红外4.1. K（K）_红外4.1大鼠脊髓P0、P15和P30的免疫反应显示出强烈的发育上调（K_红外约50和200 kD时为4.1条带）。使用肌动蛋白作为负荷控制，剥离并重新保护该印迹。

**图10**
免疫组织化学显示K_红外4.1在体内脊髓灰质星形胶质细胞中显著表达。所有图像均来自颈部、腰部和胸部50μm的固定切片。答：K（K）_红外4.1在每个脊髓节段的整个灰质中表达（标尺250μm）。**B类：**K（K）_红外4.1和GLT-1（一种星形胶质细胞特异性谷氨酸转运体）在灰质中大量重叠，然而，背角顶端（箭头）的GLT-1阳性细胞和背皮质脊髓轨道（箭头）中的星形胶质细胞却很少显示K_红外4.1免疫反应。**抄送：**K（K）_红外4.1和Neu-N（一种神经元标记物）在脊髓切片中没有显示出类似的染色模式。**医生：**K（K）_红外4.1和MBP（髓鞘碱性蛋白）是少突胶质细胞特异性标记物，在体内白质或灰质中几乎没有重叠。**电子邮箱：**K的高倍图像_红外4.1和GLT-1显示脊髓切片中这两种蛋白质重叠。B、E中的比例尺=100μm。

**图11**
原位星形胶质细胞的电生理学显示出与培养细胞相似的内向电流。答：显示应用Ba前后P15大鼠脊髓薄片线性电压放大器诱发全细胞电流的典型示例的轨迹²⁺。减去的钡灵敏电流为弱整流（A，底部）。**B类：**显示施加Ba前后代表性电压步骤的痕迹²⁺（100微米）。

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