跳到主页内容
美国国旗

美国政府的官方网站

Dot政府

政府意味着它是官方的。
联邦政府网站通常以.gov或.mil结尾。之前分享敏感信息，确保你在联邦政府政府网站。

Https系统

该站点是安全的。
这个https（https）：//确保您连接到官方网站，并且您提供的任何信息都是加密的并安全传输。

访问密钥 NCBI主页 MyNCBI主页 主要内容 主导航
.2005年12月15日；19(24):2979-90.
doi:10.1101/gad.1384005。

由前miRNA为燃料的人类、独立于ATP的RISC组装机

Elisavet Maniataki公司 1, 齐西莫斯·穆拉托斯
附属公司

由前miRNA为燃料的人类、独立于ATP的RISC组装机

埃利萨维特·马尼亚塔基等人。 基因开发. .

摘要

RNA干扰（RNAi）由RNA诱导沉默复合物（RISC）介导，该复合物由微RNA（miRNAs）或短干扰RNA（siRNAs。在人类中，RISC的催化引擎是由精氨酸二（Ago2）蛋白和miRNA（miRNP）或siRNA（siRNP）形成的核糖核蛋白。Dicer核酸酶分别从前miRNA和双链RNA（dsRNA）产生成熟的miRNA和siRNA，并与Ago2结合。在这里，我们研究了人类RISC的组装，方法是将前miRNA呈现到包含Ago2、Dicer和TRBP的免疫纯化复合物中。成熟的miRNAs是以非依赖ATP的方式产生的，并以RISC的典型模式指导同源RNA靶的特异性切割。这种从头形成的RISC活性与Dicer分离。该系统充分再现了RISC加载过程的不对称性，但无法从siRNA双工体高效组装RISC。我们的发现表明，在人类中，Ago2和Dicer在遇到前miRNA之前会形成miRNA负载复合物（miRLC），miRLC被分解，miRNP被释放。

PubMed免责声明

数字

图1。
图1。
免疫纯化Flag-Ago2含有Dicer并显示前miRNA处理活性。(A类)在四环素诱导启动子的控制下，用Flag-Ago2稳定转染293细胞。用来自非诱导（-）和四环素诱导（+）293细胞的抗Flag抗体进行免疫沉淀（IP），免疫沉淀在4%-12%NuPAGE上溶解并用银染色。(B类)免疫沉淀物来自A类用所示抗体进行Western blot分析。(C类)免疫沉淀物来自A类用含有放射性标记的5′-磷酸盐的合成前miR-30a（序列如图2A所示）孵育，在15%的UREA-PAGE上分析反应产物并通过放射自显影术进行可视化。
图2。
图2。
免疫纯化的myc-Ago2（野生型和催化不活跃型）处理前miR-30a和人工PML RNA(A、 左面板）加工反应中使用的前miR-30a的一级和二级结构。显示了加工后生成的5′末端标记成熟miR-30a-5p。红色星号表示放射性标记的5′-磷酸盐。(赖特小组）用来自293T细胞的抗myc抗体进行免疫沉淀，这些细胞转染了myc标记的野生型Ago2（myc-Ago2-WT）、无催化活性的Ago2突变体（myc-Ago2-D669A）或myc-hnRNPQ3（阴性对照）。免疫沉淀与5′-末端放射性标记的合成前miR-30a孵育。在15%UREA-PAGE上分析反应产物，并通过放射自显影法进行可视化。(B、 左面板）加工反应中使用的人工PML RNA（PML-GL3）的一级和二级结构。(赖特面板）与5′-末端放射性标记PML-GL3的加工反应。
图3。
图3。
从免疫纯化的myc-Ago2和合成的前miRNA组装功能性RISC(A类)用前miRNA测试RISC负载的两步实验方案示意图(B类)用冷的5′-磷酸化前miR-30a进行RISC负荷试验。(B、 顶部面板）使用的两种RNA（miR-30a前体和miR-30a的同源靶点）的序列和加工miR-30b前体产生的成熟miRNA（miR-30a-5p）的序列。红色星号表示RNA靶的放射性标记的5′-磷酸；闪电显示了mir-30a-5p介导的靶RNA切割的位置。(底部面板）含有免疫纯化myc-Ago2（野生型（WT）或催化失活突变型D669A（669））的琼脂糖珠首先在未标记的前miR-30a（通道4,5)或在它不存在的情况下（车道2,3). 然后清洗珠子并与5′-末端标记的miR-30a-Target孵育。第一条通道（-）显示输入目标RNA(C类)用冷的5′-磷酸化PML-GL3进行RISC负荷试验。(顶部面板）使用的RNA序列和PML-GL3加工产生的成熟GL3-24序列。(底部面板）含有myc-Ago2、野生型（WT）或D669A突变型（669）的琼脂糖珠首先与未标记的PML-GL3孵育。然后清洗珠子并与5′末端标记的GL3-Target（lanes）孵育2,3)或带有5′末端标记的miR-30a-Target（车道5)作为目标识别特异性控制。车道1和4（-），显示输入目标RNA。RNA通过17.5%UREA-PAGE分析并通过放射自显影术显示。
图4。
图4。
前miRNA加工产物在RISC上的不对称负载。(A类)pre-let-7a-3处理分析。5′-末端标记pre-let7a-3（车道1)或3′末端标记pre-let-7a-3（车道三)用myc-Ago2微球孵育，在15%UREA-PAGE上分析反应产物；产生的miRNAs（通道2,4)显示。(B类)pre-let-7a-3及其加工产品（let-7a和let-7a）的序列⋆)和相应的RNA靶点（let-7a-Target和let-7a⋆-目标）。let-7a的放射性标记5′-磷酸盐⋆-let-7a-Target的靶标和pCp（3′端）显示为红色(C类)使用pre-let7a-3进行RISC负荷分析。(顶部面板）3′末端标记let-7a-Target（车道内未反应1)用模拟预孵myc-Ago2珠（lane2)以及与pre-let7a-3（lane）预孵育的myc-Ago2珠三). (底部面板）5′-末端标记let-7a⋆-目标（车道内未反应1)用模拟myc-Ago2珠（lane2)以及与pre-let7a-3（lane）预孵育的myc-Ago2珠三).
图5。
图5。
免疫纯化的myc-Ago2复合物可以从前miRNA生成RISC，但不能从相应的siRNA双链生成，无论ATP含量如何。(A、 左面板）免疫纯化myc-Ago2-WT用于RISC组装的合成RNA；所有RNA均含有5′-磷酸盐。绿色显示的序列与GL3-靶RNA互补(赖特面板）将含有免疫纯化野生型myc-Ago2的琼脂糖珠与不存在PML-GL3 RNA的冷RNA孵育（lane2)或存在1 mM ATP和0.2 mM GTP（车道三)；或带有GL3 siRNA双链，无（通道4)或带有（车道5)ATP/GTP；或带有单链GL3-24 RNA，没有（lane6)或与（车道7)ATP/GTP。然后清洗珠子并与5′末端放射性标记的GL3-靶RNA孵育。第一条通道显示未反应的GL3-目标RNA。RNA分析如下A类. (B类)含有免疫纯化的野生型myc-Ago2复合物的琼脂糖珠通过大量洗涤而耗尽ATP。这些珠子用于RISC加载和与冷的、5′-磷酸化的和凝胶纯化的前miR030a或PML-GL3的同源靶裂解反应2,6)或存在（车道3,7)2 mM ATP和0.4 mM GTP。5′端标记的RNA靶标（泳道1,5显示未反应的靶点）也进行了凝胶纯化。巷中合成的5′末端标记18-nt RNA寡核苷酸4用作尺码标记。RNA通过17.5%UREA-PAGE分析并通过放射自显影术显示。
图6。
图6。
ATP不影响靶细胞分裂的速率。(顶部)RISC由myc-Ago2免疫沉淀物和冷PML-GL3（如图3所示）组装而成，并在不存在或存在1 mM ATP/0.2 mM GTP的情况下与5′末端标记的GL3靶RNA（10 nM）孵育。(底部)在指定的时间采集样品，用磷成像仪定量产品形成，并绘制反应时间曲线。利用Kaleidiagraph软件进行速率拟合。
图7。
图7。
RISC活性与Dicer分离。用表达V5-Dicer和myc-Ago2的质粒对293T细胞进行双重转染。用抗V5或抗myc抗体进行免疫沉淀。免疫沉淀物用于改良的RISC负载分析，其中，在前miRNA处理反应后，首先分离珠子和上清液，然后测试同源靶RNA的切割。(A、 左面板）分析示意图。(赖特面板）V5-Dicer免疫沉淀物用于改良的RISC负荷试验，带有冷的5′-磷酸化前miR-30a。5′末端标记的mir-30a-Target（车道内未反应1)与珠子一起孵化（莱恩2)或者用上清液（lane三)在处理反应后，以及与模拟上清液一起，从V5-Dicer免疫沉淀物中提取，其中没有向处理步骤中添加底物，但在靶裂解反应之前向上清液中添加了前miR30a（lane4). (B类)在改进的RISC负荷试验中，使用冷的5′-磷酸化PML-GL3作为处理底物和V5-Dicer免疫沉淀物。5′末端标记的PML-GL3-Target（车道内未反应1)与珠子一起孵化（莱恩2)或与上清液（泳道三)从加工反应以及模拟上清液中，从V5-Dicer免疫沉淀物中获得，其中没有向加工步骤中添加底物，但在靶裂解反应之前，冷的5′-磷酸化PML-GL3（PML；lane4)，5′-磷酸化GL3 siRNA双链（si；lane5)或5′-磷酸化GL3-24（as；车道6)已添加。(C、 左面板）分析示意图。(赖特面板）myc-Ago2免疫沉淀用于改良的RISC加载方案，以冷的5′-磷酸化PML-GL3作为处理底物。5′末端标记的PML-GL3-Target与珠子（lane）一起孵育1)或与上清液（泳道2)来自加工反应。
图8。
图8。
前miRNAs人类RISC组装的工作模型。
请参阅PMC中的此图像和版权信息

类似文章

  • miRNA和RNAi途径成分的细胞内定位和路由。
    Ohrt T、Muetze J、Svoboda P、Schwille P。 Ohrt T等人。 当前顶级药物化学。2012;12(2):79-88. doi:10.2174/1568026127989132。 当前顶级药物化学。2012 PMID：22196276 审查。
  • 体外阐明哺乳动物RISC组装。
    Tan GS、Garchow BG、Liu X、Metzler D、Kiriakidou M。 Tan GS等人。 BMC分子生物学。2011年4月29日；12:19. doi:10.1186/1471-2199-12-19。 BMC分子生物学。2011 PMID：21529364 免费PMC文章。
  • 阿尔戈纳特人。
    乔舒亚·托尔·L。 乔舒亚·托尔·L。 冷泉Harb Symb Quant生物。2006;71:67-72. doi:10.1101/sqb.2006.71.048。 冷泉Harb Symb Quant生物。2006 PMID：17381282 审查。
  • 人类RISC将microRNA生物发生和转录后基因沉默结合在一起。
    Gregory RI、Chendrimada TP、Cooch N、Shiekhattar R。 Gregory RI等人。 单元格。2005年11月18日；123(4):631-40. doi:10.1016/j.cell.2005.10.022。Epub 2005年11月3日。 单元格。2005 PMID：16271387
  • TRBP将Dicer复合物招募到Ago2中，用于微RNA处理和基因沉默。
    Chendrimada TP、Gregory RI、Kumaraswamy E、Norman J、Cooch N、Nishikura K、Shiekhattar R。 Chendrimada TP等人。 自然。2005年8月4日；436(7051):740-4. doi:10.1038/nature03868。Epub 2005年6月22日。 自然。2005 PMID：15973356 免费PMC文章。
查看所有类似文章

引用人

查看所有“被引用”文章

工具书类

    1. Ambros V.2004年。动物microRNA的功能。自然431:350-355。-公共医学
    1. 巴特尔D.P.2004。微RNA：基因组学、生物发生、机制和功能。手机116:281-297。-公共医学
    1. Bernstein E.、Caudy A.A.、Hammond S.M.和Hannon G.J.，2001年。双齿核糖核酸酶在RNA干扰起始步骤中的作用。自然409:363-366。-公共医学
    1. Bohnsack M.T.、Czaplinski，K.和Gorlich，D.，2004年。Exportin 5是一种RanGTP依赖的dsRNA-结合蛋白，调节前miRNAs的核输出。RNA 10:185-191。-项目管理咨询公司-公共医学
    1. Carmell M.A.、Xuan Z.、Zhang M.Q.和Hannon G.J.，2002年。Argonaute家族：涉及RNAi、发育控制、干细胞维护和肿瘤发生的触须。基因与发育16:2733-2742。-公共医学

出版物类型