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.2006年1月；26(1):209-20.
doi:10.1128/MCB.26.1209-220.2006。

Notch激活是Ikaros缺陷小鼠T细胞白血病发生的早期关键事件

亚历克西斯·杜莫提尔 1, 罗宾·珍妮特, 佩吉·柯斯特特, 伊娃·克莱曼, MacLean Sellars公司, 努诺·多斯桑托斯, 克里斯蒂尔·蒂鲍特, 约钦·巴思, 雅克·盖斯达尔, 詹妮弗·阿蓬特, 菲利普·卡斯特纳, 苏珊·陈
附属公司

Notch激活是Ikaros缺陷小鼠T细胞白血病发生的早期关键事件

亚历克西斯·杜莫提尔等。 分子细胞生物学. 2006年1月.

摘要

Ikaros转录因子既是淋巴细胞分化的关键调节因子，也是T淋巴细胞的肿瘤抑制因子。携带Ikaros基因低形态突变（Ik（L/L））的小鼠都会发展为胸腺淋巴瘤。Ik（L/L）肿瘤总是表现出强烈的Notch通路激活，这是肿瘤细胞体外增殖所必需的。Notch激活发生在肿瘤发生的早期，可能发生在转化之前，因为Notch靶点Hes-1和Deltex-1在没有明显转化迹象的幼年Ik（L/L）小鼠的胸腺细胞中检测到异位表达。导致Notch 1的C末端截断的二次突变进一步放大了Notch激活。令人惊讶的是，肿瘤细胞中Ikaros活性的恢复导致Notch靶基因表达的快速特异性下调和增殖抑制。此外，Ikaros与Hes-1启动子中的Notch响应元件结合，并抑制来自该启动子的Notch依赖性转录。因此，Ikaros介导的Notch靶基因表达抑制可能在确定该因子的肿瘤抑制功能中发挥关键作用。

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数字

图1。
图1。
Ik的表型和胸腺需要量升/升肿瘤。（A） WT胸腺（4周龄小鼠）的快照，早期Ik升/升肿瘤（13周龄小鼠）和晚期Ik升/升肿瘤（22周龄小鼠），脾和肾转移。Th，胸腺；五十、 肺；H、 心脏；李，肝脏。（B） 左面板：流式细胞术分析WT和非转化Ik胸腺细胞上CD4、CD8和TCRαβ的表达升/升胸腺（3周龄小鼠）和Ik早期和晚期升/升肿瘤。直方图显示总胸腺细胞上TCRαβ的表达。结果显示了针对每个案例研究的20多个样本的代表性。右面板：WT、癌前Ik DNA中Dβ2-Jβ2重排的PCR分析升/升胸腺细胞和独特的Ik升/升肿瘤。结果代表了10个样本。
图2。
图2。
Ik过度增殖+/L（左）和Ik升/升胸腺细胞和T细胞对抗CD3刺激和胸腺对肿瘤发生的需求。（A） 用CFSE标记细胞，用板结合抗CD3刺激细胞3天。通过分析门控活细胞的CFSE损失来观察增殖。结果代表了4个类似的实验。（B） 顶部面板：WT和Ik升/升小鼠在5周龄时被切除胸腺(n个=每组10）。该图显示了手术后1.5年内监测的小鼠存活曲线。一个胸腺切除的Ik升/升在此期间，小鼠死于非癌症相关原因。所有未切除胸腺的Ik升/升小鼠死于胸腺淋巴瘤。底部面板：来自胸腺切除WT和Ik的淋巴结T细胞的CD4/CD8表达升/升小鼠术后1.5年。数字表示每个门中的单元百分比。结果代表了4个实验。
图3。
图3。
Ik中Notch通路的激活升/升肿瘤。（A） 微阵列数据的层次聚类区域，显示在所有Ik中显著过度表达的14个基因升/升肿瘤。样品命名：T，Ik升/升肿瘤；Tel-Jak，来自Tel-JAK2转基因小鼠的肿瘤；WT，未分化的WT胸腺细胞（3周龄小鼠）；艾克升/升，普通Ik升/升癌前胸腺细胞（3周龄小鼠）。红色表示上调基因；绿色表示下调基因。（B） WT胸腺细胞纯化亚群和早期Ik中Notch通路基因的RT-PCR升/升肿瘤。DN，CD4负极CD8（CD8）负极CD3（CD3）负极; DP，CD4细胞+CD8（CD8）+CD3（CD3）洛; CD4 SP、CD4+CD8（CD8）负极CD3（CD3）你好; CD8 SP、CD4负极CD8（CD8）+CD3（CD3）你好。排序门显示在随附的点斑点中。单个基因的PCR在相同的凝胶上运行，但在图中分开，以更好地区分样本。代表性数据来自6个不同的早期Ik升/升肿瘤。（C） WT和癌前Ik纯化亚群Notch通路基因的RT-PCR升/升胸腺细胞（4周龄小鼠）。PCR产物被印迹，并与每个基因的特定内部寡核苷酸探针杂交。结果代表了三个类似的实验。（D） 使用来自4个WT和4个Ik的样本对Deltex-1和Hes-1的DP胸腺细胞进行实时RT-PCR升/升小鼠（4周龄），包括用于C组的小鼠*，P（P）< 0.01.
图4。
图4。
Notch 1在原代Ik中的过度表达升/升肿瘤和PEST突变的存在。（A） WT和后期Ik的核提取物（3μg）升/升用抗裂解Notch1抗体进行Western blotting分析肿瘤。注意切割的NIC-1蛋白的存在及其大小的变化。（B） 顶部面板：Notch 1 cDNA的比较。顶行表示Notch 1 cDNA。NIC-1对应于nt 5259至9193。cDNA测序（nt 6614至7675）与PEST结构域周围的区域相对应。黑框表示PEST编码区域（nt 7495至7564）。下面，粗体向下箭头对应于突变位点。下面的线对应于Ik的RNA序列比对升/升肿瘤，其中向上的箭头表示插入，方框表示组合删除插入，圆点表示删除。小鼠的年龄（周）如下：T102，22；T72，24；T99，22；T103，18；T172，17；T157，19；T81、23。T81肿瘤包含2种不同的突变以及WT序列。所有小鼠肿瘤发育良好，并表达较小的NIC-1。对一只WT小鼠的五个亚克隆进行了测序和克隆；没有发现突变（未显示）。底部面板：上述NIC-1区域蛋白质序列的比对和预测。顶行表示WT NIC-1。星号表示肿瘤样本中存在预测的终止密码子。
图5：。
图5：。
艾克升/升肿瘤的增殖需要Notch激活。（A） Ik的表型升/升肿瘤细胞系。来自不同原代Ik的T64和T29细胞系的CD4/CD8表达升/升肿瘤。还建立了另外两个品系（T153和T68），并给出了类似的结果（未显示）。（B） T64和T29细胞Notch通路基因的RT-PCR分析与WT和预转化Ik的比较升/升胸腺细胞。（C） T64和T29细胞核提取物和原代Ik裂解NIC-1蛋白的Western blot升/升肿瘤（每个5μg）。（D） 在第0天用MigR1或Mig-NIC逆转录病毒载体转导T29细胞系，并在第3天添加或不添加5 mM GSI的情况下培养。通过GFP报告基因的表达将转导细胞与非转导细胞区分开来。累计GFP+在6天内显示单元格数。使用1μM GSI获得了类似的结果。（E） 在添加（+）或不添加（−）GSI后48 h提取RNA（培养第5天）。通过RT-PCR分析β-肌动蛋白、Deltex-1和Hes-1的表达。结果代表了4个实验。其他Ik也获得了类似的结果升/升肿瘤细胞系。
图6。
图6。
Ik中Notch通路基因表达的抑制升/升表达Ik1或Ik1*的肿瘤细胞系。（A） 用指示的逆转录病毒转导T29细胞，并在转导到GFP后48小时分类你好和GFP负极人口。（B） 通过RT-PCR分析指示基因的表达。结果代表了5个实验。+，存在；−，不存在。（C） 实时RT-PCR数据是从两个独立实验中转导的T29和T64细胞获得的，与面板b中显示的结果不同。（D）T29细胞系在第0天用MigR1、Mig-Ik1或Mig-Ik1*转导，并培养5天。累计GFP你好显示单元格。其他Ik也获得了类似的结果升/升肿瘤细胞系。结果代表了5个实验。
图7。
图7。
Ik1和Ik1*亚型与Hes-1启动子的CSL/RBP-Jk结合位点结合。（A） 使用Hes-1启动子（AB）片段从−91到−57的EMSA（22）。CSL/RBP-Jk结合位点的两个核心序列用黑体字标记。AmB，位点A突变；ABm，B位点突变；AmBm，位点A和B突变。箭头显示了不同的Ikaros复合体。突变的结合位点以斜体显示。对照IkBS4探针包含高亲和力Ikaros结合位点（37）。使用3μg来自转染Ik1或Ik1*表达载体或pBlueScript（模拟）的Cos细胞的核提取物进行所有分析，并重复3次，结果相似。凝胶上的多条带可能对应于单体、二聚体和多聚体Ikaros复合物（52）。请注意，与Ik1*生成的复合物的电泳迁移率稍高，这反映了与Ik1相比，蛋白质的尺寸较小。（B） 使用包含两个CSL/RBP-Jk结合位点（a和B）的Hes-1 luc报告子或删除a和B位点的Hes-1ΔAB luc报告员进行荧光素酶报告基因分析。HeLa细胞与所示质粒（+，有；-，无）以及雷尼利亚荧光素酶质粒进行标准化。通过添加空载体使总DNA含量保持恒定。黑色楔形图显示Ik1表达载体在这些样本中的浓度增加：1μg、1.5μg、2μg。误差条显示了一个实验的标准偏差，一式三份。结果代表了3个实验。
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参考文献

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