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.2005年12月2日；123(5):903-15.
doi:10.1016/j.cell.2005.09.021。

α-catenin是一种分子开关，结合E-cadherin-β-catenin并调节肌动蛋白纤维组装

弗劳克·德雷斯 1, 萨宾·波库塔, 山田宗一郎, W詹姆斯·纳尔逊, 威廉·魏斯
附属公司

α-catenin是一种分子开关，结合E-cadherin-β-catenin并调节肌动蛋白纤维组装

弗劳克·德雷斯等。 单元格. .

摘要

上皮细胞-细胞连接由粘附蛋白和底层肌动蛋白细胞骨架组织，被认为是维持组织结构完整性的稳定结构。与α-钙调素通过β-catenin将粘附蛋白E-cadherin连接到肌动蛋白细胞骨架的想法相反，在随附的论文中，我们报告了α-钙调节素不会同时与E-cadherin-beta-catenin和肌动蛋白丝结合。在这里，我们证明α-胡萝卜素以单体或同二聚体的形式存在，具有不同的结合性质。单体α-钙素与E-钙粘蛋白-β-钙素结合更强，而二聚体优先与肌动蛋白丝结合。不同的分子构象与这些不同的结合状态有关，表明α-钙调素是一种变构蛋白。值得注意的是，α-胡萝卜素通过抑制Arp2/3-介导的肌动蛋白聚合直接调节肌动蛋白丝的组织，可能是通过与Arp2/3复合物竞争以结合肌动蛋白纤维。这些结果表明，α-钙素在钙粘蛋白介导的细胞-细胞粘附位点的肌动蛋白组装和组织的局部调节中发挥了新的作用。

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数字

图1
图1。低聚物状态α-连环蛋白
（A） MDCK细胞胞浆的Superdex 200凝胶过滤色谱。通过SDS-PAGE和随后的蛋白质印迹分析凝胶过滤运行的级分。α-catenin（红色）和β-catenin（绿色）在对应于重组蛋白峰分数的柱分数中被鉴定α-连环蛋白单体和二聚体。的频带强度α-根据分数绘制了catenin和β-catenin带。（B） 从MALS实验获得的分子质量与洗脱体积分布图。90°角探测器的光散射信号的轨迹显示为虚线。（C） 左侧凝胶显示使用（a）中所示的MDCK细胞裂解物的Superdex 200凝胶过滤运行的级分8的抗β-连环蛋白抗体的免疫沉淀。用免疫印迹法分析上清液和颗粒-α-catenin和抗β-catenin抗体。未偶联抗体的蛋白A珠用作对照。右边的凝胶显示GFP之间形成混合二聚体-α-连环蛋白与内源性α-通过免疫沉淀法分析表达GFP的MDCK细胞胞浆部分的连环蛋白-α-catenin与抗GFP抗体。凝胶被抗-α-连环蛋白抗体。使用抗GST抗体的免疫沉淀物颗粒显示为对照。（D） β的MALS分析α-catenin分子量。
图2
图2。β-连环蛋白和肌动蛋白结合活性α-连环蛋白单体和二聚体
（A） Superdex 200凝胶过滤色谱法α-连环蛋白二聚体和β-连环蛋白孵育过夜（红线）和单个蛋白质，α-catenin二聚体（蓝色）和β-catenin（黑色）。右侧显示了通过SDS-PAGE分析的各个批次的馏分。峰值分数用彩色条表示。（B） 凝胶过滤色谱法，如（A）所述α-连环蛋白单体。（C） GST-E-钙粘蛋白胞质域（10μM）和β-连环蛋白（10μM）与α-指示浓度下的连环蛋白单体或二聚体。在GST-琼脂糖微球上分离蛋白质复合物，并通过SDS-PAGE进行分析。在含有β-catenin的样品中可以看到未分离的污染GST-β-catentin的背景结合。（D） 单体和二聚体沉淀α-在存在和不存在F-肌动蛋白的情况下的连环蛋白。用SDS-PAGE分析含有未结合蛋白的上清液S和含有肌动蛋白结合蛋白的颗粒P。
图3
图3。的构象性质α-连环蛋白及其与文丘林的比较
（A） 文丘林在凝胶过滤柱上的洗脱表观分子量低于α-连环蛋白。采用Superdex 200凝胶过滤色谱分析MDCK细胞胞浆。通过SDS-PAGE和随后的Western blotting分析组分α-catenin和vinculin。Intensities of theα-根据分数绘制了catenin和vinculin带。（B） 蛋白质水解敏感性α-连环蛋白单体、同二聚体和β-连环蛋白-α-catenin嵌合体。SDS-PAGE共页α-连环蛋白单体、二聚体和βα-连环蛋白嵌合体与胰蛋白酶孵育0分钟、5分钟、15分钟、30分钟、1小时、2小时和4小时。星号表示降解产物α-连环蛋白单体。分子量标记显示在左侧。先前已确定所示二聚和M结构域分别包含残基82–264和385–651（Pokutta等人，2002；Pokutta-Weis，2000）。
图4
图4。交换α-钙粘蛋白-β-连环蛋白复合物中的连环蛋白
（A和B）肌动蛋白丝在预装配E-钙粘蛋白-β-连环蛋白存在下的沉积-α-catenin复合物。通过凝胶过滤分离预组装的钙粘蛋白-钙粘蛋白复合物，并与肌动蛋白丝混合，同时改变复合物的浓度（A）和孵育时间（B），然后离心沉淀肌动蛋白纤维和相关蛋白。E-cadherin和β-catenin在背景水平以上未形成颗粒。车道α不含E-cadherin或β-catenin。（C） 内源性和绿色荧光蛋白的细胞分布-α-清洁剂提取稳定表达GFP的MDCK细胞后的连环蛋白-α-连环蛋白。裂解液在SDS-PAGE上运行，并用抗-α-连环蛋白抗体。内源性和GFP标记α-catenin分别用实心圆圈和星形表示。（D） 浸提前和浸提后的图像以及相应的GFP后移图-α-细胞间接触的catenin。恒星表示光浸激光光斑的位置，而线条则表示在日程表中绘制的强度分布。日程表中的条显示了激光光漂白的持续时间，数字是以分钟为单位的时间。荧光强度标度为假彩色，如图所示。（E） GFP细胞质（蓝色）和膜结合（红色）池的时间依赖性强度分布-α-FLIP后的catenin如（D）所示。数据点是15个独立实验的平均值，误差条代表SEM。时间（min）在x轴上表示。
图5
图5。α-连环蛋白抑制Arp2/3-介导的肌动蛋白动力学
的影响α-连环蛋白、β-连环蛋白和α-肌动蛋白对Arp2/3-介导的肌动蛋白聚合作用的测定采用芘-肌动蛋白法。组装反应包含5μM肌动蛋白（含10%芘肌动蛋白）、50 nM Arp2/3复合物、50 nMWASp-VCA和5μM指示蛋白。（A） 单独肌动蛋白或在有或无VCA的Arp2/3复合物存在下。（B–H）Arp2/3介导的肌动蛋白聚合α-连环蛋白单体（B），α-连环蛋白单体和β连环蛋白（C）、β连环素（D）、βα-catenin嵌合体（E），α-连环蛋白二聚体（F），α-catenin尾域aa 671–906（G），或α-肌动蛋白（H）。
图6
图6。α-连环蛋白与Arp2/3竞争与肌动蛋白丝的结合
（A） 存在或不存在5μM时肌动蛋白的临界浓度α-连环蛋白同二聚体。插入显示与临界浓度对应的曲线的交点。F=聚合缓冲液中的肌动蛋白；G=G缓冲液中的肌动蛋白。（B） Arp2/3与商品及服务税的结合-α-catenin或GST-WASp-VCA。GST、GST的抗-Arp3 Western blot珠结合试验-α-catenin（GST）-α)和带有纯化Arp2/3复合物的GST-WASp-VCA（GST-VCA）。SN=上清液；PE=颗粒。（C） 浓度依赖性α-在芘-肌动蛋白分析中测量Arp2/3上的连环蛋白单体和同二聚体以及VCA刺激的肌动蛋白聚合。α-将浓度在0.1至20μM之间的连环蛋白添加到含有10%芘肌动蛋白、50 nM Arp2/3复合物和50 nM WASp-VCA的5μM肌动蛋白中，并通过沉降监测肌动蛋白纤维组装（见[D]）。（D） 达到平衡后（t>2小时），对聚合样品的F-actin颗粒（PE）和上清液（SN）进行Western blot分析（C）。用抗-α-catenin（抗鼠λ680）和抗Arp3（抗兔λ800），定量，并用抗肌动蛋白（抗小鼠λ800），使所有三个抗体信号在λ800通道。（E） 从（D）定量蛋白质印迹带强度。Arp3强度与每条车道的肌动蛋白强度进行标准化，并与α-连环蛋白浓度。
图7
图7。的模型α-连环蛋白在调节肌动蛋白动力学和组织中的作用
最初的细胞-细胞接触是由跛足足细胞膜上的钙粘蛋白相互作用介导的。钙粘蛋白在新生接触点的聚集导致钙粘蛋白-钙粘蛋白复合物的积累。局部高浓度α-当catenin与这些复合物分离时，就会产生catenin。α-连环蛋白以单体或同二聚体的形式存在，与Arp2/3复合物竞争肌动蛋白丝（二聚体比单体更有效），从而抑制Arp2/3介导的驱动跛足足的肌动蛋白组装。α-catenin还捆绑肌动蛋白丝，这可能有助于成熟接触中肌动蛋白的重组。
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