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.2005年11月24日；33(20):6566-78.
doi:10.1093/nar/gki965。 2005年印刷。

SIP1/ZEB2通过抑制不同上皮细胞-细胞连接的基因诱导EMT

辛迪·范德维尔 1, 笑话漫画, 布拉姆·德克雷恩, 佩特拉·弗马森, 埃里克·布吕内尔, 安徒生（Henriette Andersen）, 尤金·图尔钦斯基, 弗兰斯·范罗伊, 吉尔特·伯克斯
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SIP1/ZEB2通过抑制不同上皮细胞-细胞连接的基因诱导EMT

辛迪·范德维尔等。 核酸研究. .

摘要

SIP1/ZEB2是双手锌指核因子deltaEF-1家族的成员。这些转录因子的表达与发育过程中的上皮-间充质转化（EMT）有关。SIP1也在一些乳腺癌细胞系中表达，并在肠胃癌中检测到，其表达与E-cadherin的表达呈负相关。这里，我们表明SIP1在人类上皮细胞中的表达导致了从上皮表型到间充质表型的明显形态学变化。这种上皮脱分化的诱导伴随着一些细胞连接蛋白的抑制，同时伴随着其mRNA水平的抑制。除E-cadherin外，编码紧密连接、桥粒和缝隙连接关键蛋白的其他基因也被转录阻遏物SIP1调控。此外，通过荧光素酶报告子分析和染色质免疫沉淀对所选基因启动子区域的研究表明，抑制是由SIP1直接介导的。这些数据表明，在上皮去分化过程中，SIP1以协调的方式抑制编码有助于去分化状态的连接蛋白的基因的转录；这种抑制通过Smad相互作用蛋白1（SIP1）结合位点介导的一般机制发生。

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数字

图1
图1
稳定转染剂DLD1Tr21/WTSIP1和A431/WTSIP1-SIP1表达SIP1。(A类)相位对比图像显示了SIP1诱导后的形态变化在体外未诱导的DLD1Tr21/WTSIP1和A431/WTSIP-1细胞系显示出一般的上皮表型。WTSIP1诱导这些细胞发生明显的形态学改变，而突变SIP1则没有。(B类)用针对myc-tag的单克隆抗体进行的免疫荧光分析证实了非诱导细胞系中SIP1蛋白的缺失及其在诱导细胞系的存在。
图2
图2
钙粘附素-连环蛋白复合物不同蛋白在SIP1诱导下的行为。(A类)使用粘附连接成分特异性抗体对非诱导和诱导DLD1Tr21/WTSIP1细胞进行免疫荧光显微镜检查。在SIP1诱导的细胞中，E-cadherin以及αE-catenin、p120ctn和β-catenin在细胞接触处几乎无法检测到。(B类)非诱导和诱导DLD1Tr21/WTSIP1细胞系的Western blot分析。在SIP1表达细胞中，E-cadherin和αE-catenin在蛋白水平下调。与非诱导细胞相比，SIP1诱导的细胞中β-catenin蛋白水平没有改变。SIP1诱导后，p120ctn亚型1的蛋白表达上调，亚型3的蛋白表达下调(*：每2天添加一次Dox，**：将Dox从细胞培养基中洗掉）。
图3
图3
DLD1Tr21/WTSIP1细胞中SIP1表达诱导E-cadherin mRNA下调。Q-RT–PCR检测SIP1和E-cadherin的mRNA表达。在SIP1诱导12小时后，E-cadherin的下调已经很明显。诱导24小时后观察到最大抑制。待定放大用于使数值标准化。
图4
图4
野生型SIP1诱导细胞聚集和侵袭的丧失，而突变型SIP1.则没有。(A类)快速聚集分析。在时间0（N0）时，在液体细胞悬浮液中未检测到细胞聚集。30分钟后，表达突变SIP1的DLD1Tr21细胞系检测到细胞-细胞聚集，但当细胞系表达野生型SIP1时，未检测到聚集。(B类)通过诱导（+Dox）野生型SIP1的表达诱导入侵I型胶原，但不是由突变的SIP1诱导。
图5
图5
SIP1下调上皮细胞紧密、粘附、桥粒和缝隙连接成分的mRNA表达水平。在用Dox（在12小时、24小时和48小时）或不用Dox诱导后，从DLD1Tr21/WTSIP1和DLD1Tr21/mutSIP1细胞系中分离总RNA。将所示基因的Q-RT-PCR分析与微阵列结果进行比较。很明显，所有这些转录物都被WTSIP1下调，但在表达突变SIP1的细胞系中，它们的表达都没有受到影响。放大TBP（待定）,UBC公司和GAPD公司用于规范化值。
图6
图6
SIP1下调紧密连接和桥粒的不同蛋白质。使用紧密连接和桥粒组分的特异性抗体对未诱导和诱导的DLD1Tr21/WTSIP1和A431/WTSIPI细胞进行免疫荧光显微镜检查。SIP1表达降低结蛋白激酶的表达PKP2系列在接触区域。紧密连接处Claudin 4的表达受SIP1表达的影响。在DLD1Tr21/WTSIP1中进行DAPI染色，在A431/WTSIPI中进行PI（碘化丙啶）染色，以显示相同细胞场的细胞核。
图7
图7
SIP1诱导后A431/WTSIP1中的Cadherin切换。(A类)A431/WTSIP1中E-cadherin和N-cadherin mRNA的Q-RT-PCR。在SIP1诱导48小时后，E-cadherin明显下调，而N-cadherin mRNA上调。TBP（待定）和GAPD公司放大用于使数值标准化。(B类)Western blot分析显示，在SIP1诱导后，E-cadherin和N-cadherin蛋白水平之间存在类似的负相关。
图8
图8
SIP1转录下调几个细胞间连接复合体的基因。(A类)E-钙粘蛋白、P-钙粘素、克劳丁4和连接蛋白26的克隆启动子区域的示意图。指出了推测的SIP1-结合位点。(B类)人类E-cadherin启动子（7）和人类连接蛋白26启动子的SIP1结合位点产生突变。E2-方框为灰色阴影。Mut 4携带突变CAGGTG→CAGA类TG；Mut 2+4携带2个相同的CAGGTG→CAGA类TG突变；静音1+2+4携带额外的AGGTG→AGA类TG突变；Mut 1+2+3+4携带上述3种突变，并具有CACCT→CAT型SIP1结合位点3的CT突变。(C类)转染MCF7/AZ细胞提取物的启动子活性测定。用SIP1表达载体和荧光素酶启动子构建物共同转染细胞，用于E-钙粘蛋白、P-钙粘素、克劳丁4或连接蛋白26。SIP1与启动子结构的共表达导致启动子活性下调。连接蛋白26启动子中所有4个SIP1-结合元件的突变（参见B）减轻了SIP1的抑制活性。少于4个SIP1结合序列的突变保留了SIP1的抑制作用。荧光素酶值与β-半乳糖苷酶活性标准化。
图9
图9
SIP1在染色质水平上与细胞连接基因的启动子区域相关。(A类)SIP1抑制的连接基因的启动子区域。启动子区、5′非翻译区（5′-UTR）、开放阅读框（ORF）和内含子是根据转录起始位点数据库中的序列信息定义的()和公共人类基因组DNA数据库()使用基因符号下提到的Refseq ID。绘制了CACCT（G）和（C）AGGTG框。染色质免疫沉淀中分析的扩增子显示为黑色条。(B类)在24小时内，DLD1Tr21/WTSIP1和A431/WTSIP-1细胞未被诱导或被Dox诱导。体内通过ChIP分析确定的SIP1与DLDTr21/WTSIP1和A431/WTSIP-1细胞中近端启动子序列的结合。结合序列的富集通过定量实时PCR进行量化，并描述为在Dox诱导细胞与非诱导细胞中检测到的SIP1与SIP1特异性抗体关联的倍数增加。使用无关的IgG抗体确定背景，并描述为诱导细胞与非诱导细胞的倍数增加。无关序列（Irr.seq.）是扩增的远端启动子序列，位于E-cadherin、plakophilin 2、紧密连接蛋白3和连接蛋白26转录起始位点上游4-7kb。
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