跳到主页内容
美国国旗

美国政府的官方网站

Dot政府

gov意味着它是官方的。
联邦政府网站通常以.gov或.mil结尾。之前分享敏感信息，确保你在联邦政府政府网站。

Https系统

该站点是安全的。
这个https（https）：//确保您连接到官方网站，并且您提供的任何信息都是加密的并安全传输。

访问密钥 NCBI主页 MyNCBI主页 主要内容 主导航
.2005年11月22日；102(47):16961-6.
doi:10.1073/pnas.0506482102。 Epub 2005年11月15日。

MicroRNAs通过抑制真核启动因子4E/cap和poly（A）尾部功能来控制翻译启动

大卫·T·汉弗莱斯 1, 贝琳达·J·韦斯特曼, 大卫·I·K·马丁, 托马斯·普莱斯
附属公司

MicroRNAs通过抑制真核启动因子4E/cap和poly（A）尾部功能来控制翻译启动

大卫·T·汉弗莱斯等。 美国国家科学院程序. .

摘要

微小RNA（miRNA）通过与3'UTR中部分错配的序列相互作用来抑制靶mRNA的翻译。他们对翻译起作用的机制在很大程度上仍不清楚。我们检测了与同源miRNA共同转染的HeLa细胞中3’UTR中含有四个部分错配miRNA-结合位点的mRNA的翻译。mRNA通过体外转录制备，并被设计为采用不同的翻译起始模式。我们发现5'帽状结构和3'聚（A）尾对于miRNA介导的mRNA翻译的完全抑制是必要的，但并不充分。用蟋蟀麻痹病毒或脑心肌炎病毒的内部核糖体进入位点替换帽结构会削弱miRNA-介导的抑制。总之，这些结果表明miRNA干扰翻译的起始步骤，并暗示帽结合蛋白真核起始因子4E作为分子靶标。

PubMed免责声明

数字

图1。
图1。
miRNAs以翻译起始步骤为靶点。用R-luc mRNA、F-luc控制mRNA和（如有指示）合成miRNA共同转染HeLa细胞let-7对照miRNA，不含miRNA。每次转染的R-luc活性均归一化为相应的F-luc测量值。(一个)四种R-luc测试mRNA。R-luc-4位点和-0位点为m7G（5′）ppp（5′。R-luc-4位点mRNA的另外两个变体携带野生型CrPV基因间IRES或一个非活性突变体（星号表示，参考文献37）。CrPV IRES mRNA携带一个A-cap，并且没有多聚腺苷化。(B类)CXCR4 miRNA的抑制。通过将不含miRNA的标准化R-luc活性除以存在miRNA时的标准化R-luc活性来计算抑制。条形图主要表示三到五个独立的三重实验的平均结果（填充条形图，CXCR4；开放条形图，let-7). 误差线表示适当的标准偏差。(C类)CrPV IRES的活性。Bars表示具有突变或野生型CrPV IRES mRNA的标准化R-luc活性（未添加miRNA；野生型IRES的表达表示为1.0）。野生型CrPV IRES驱动的R-luc表达效率低下，但仍比模拟转染对照的背景读数高约3个数量级。显示了两个独立的三重实验的平均结果。
图2。
图2。
miRNA-介导的阻遏需要5′帽结构和poly（A）尾。如图1所示，HeLa细胞与mRNA和miRNAs共转染。(一个)R-luc-4位点mRNA示意图。(B类)四个R-luc-4位点mRNA的正常化R-luc活性（未添加miRNA；帽和尾mRNA的表达设置为1.0）。两个（A-cap）或五个实验的平均结果显示为适当的标准偏差。(C类)miRNA抑制（如图1所示计算B类). 三到五次实验的平均结果以标准偏差显示（填充条，CXCR4；开放条，let-7). (D类)CXCR4 miRNA对不同R-luc-4位点mRNA的抑制在相似的miRNA水平下达到饱和。根据转染混合物中miRNA浓度的函数测量效果，并按照图1计算B类大多数数据点表示三个实验的平均结果，在适当的情况下具有标准偏差（正方形、帽状物；菱形、尾部；圆形、帽状物和尾部）。
图3。
图3。
miRNA/靶相互作用不会触发mRNA加速衰变。(一个)将HeLa细胞的多个等分试样与R-luc-4位点和F-luc对照mRNA共转染(▪) 或不含CXCR4 miRNA（•），并在不同时间收获。R-luc表达未标准化为F-luc。将这类时间序列的五个时间序列分别缩放到回收的R-luc蛋白的总水平，然后求平均值。误差线表示标准偏差。细胞中mRNA的功能半衰期定义为R-luc活性半最大积累所需的时间（43）。(B类)HeLa细胞与R-luc-4位点mRNA、CXCR4 miRNA（如上所述）和F-luc对照mRNA（第4-8条）共转染。转染7小时后分离总RNA，并对1μg等分样品进行双亲核糖核酸酶保护试验。显示未消化探针混合物（通道1）、输入R-luc和F-luc mRNA的模型反应（标记，通道2）以及未转染HeLa细胞的总RNA（通道3），以进行比较。右侧显示了探针和受保护碎片的位置。相同凝胶的不同“暴露”显示在插入物的上半部和下半部。下面的框列出了相对于车道7中的值的R-luc/F-luc波段强度比。每次分析也使用5μg总RNA进行，以确定探针过量的条件（数据未显示）。(C类)共转染细胞并分离总RNA，如B类然后进行RT-PCR分析（参见材料和方法)带有对R-luc-4位点mRNA（跨miRNA靶位点）或F-luc控制mRNA特异的引物对。由于PCR引物退火到miRNA靶两侧的位点，miRNA诱导的切割应减少或消除R-luc PCR产物。在15、18、21和24个周期后对PCR产物进行分析，以证明PCR扩增的饱和（面板仅显示18个周期后的PCR产物）。在该实验中，miRNA-介导的R-luc抑制约为4.5倍（数据未显示）。转染后16小时分离的RNA（数据未显示）和三个独立的转染实验获得了等效结果。
图4。
图4。
EMCV IRES元件损害miRNA阻遏。如图1和图2所示，用mRNA和miRNAs共同转染HeLa细胞。(一个)本实验中使用的R-luc-4位点mRNAs示意图：它们携带标准的5′UTR或EMCV IRES，无论是否带有poly（a）尾巴；所有这些都是A-caped。(B类)四种版本R-luc-4位点mRNA的标准化R-luc活性（未添加miRNA；EMCV和tail mRNA的表达设置为1.0）。两个（A-cap）到四个实验的平均结果显示为适当的标准偏差。(C类)miRNA抑制（如图1所示计算B类和2C类). 三到五次实验的平均结果以标准偏差显示（填充条，CXCR4；开放条，let-7).
请参阅PMC中的此图像和版权信息

类似文章

查看所有类似文章

引用人

查看所有“被引用”文章

工具书类

    1. Bartel，D.P.（2004）细胞116，281-297。-公共医学
    1. He，L.和Hannon，G.J.（2004）《自然评论遗传学》。5, 522-531.-公共医学
    1. Meister，G.&Tuschl，T.（2004）《自然》431，343-349。-公共医学
    1. Ambros，V.（2004）《自然》431，350-355。-公共医学
    1. Cullen，B.R.（2004）《分子细胞》第16期，861-865页。-公共医学

出版物类型