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.2005年11月；62(22):2669-78.
doi:10.1007/s00018-005-5318-6。

药物治疗挽救Hutchinson-Gilford早衰患者的异染色质组织

M科伦巴罗 1, C卡帕尼, E马蒂奥利, G诺维利, V K帕奈克, S方形, N M马拉尔迪, G拉坦齐
附属公司

药物治疗挽救Hutchinson-Gilford早衰患者的异染色质组织

M科伦巴罗等。 细胞分子生命科学. 2005年11月.

摘要

Hutchinson-Gilford早衰（HGPS）是一种与LMNA突变相关的早衰综合征。带有G608G LMNA突变的前体细胞的特征是累积突变的层粘连蛋白a前体（前体蛋白）、核异形和染色质紊乱。在培养的HGPS成纤维细胞中，我们发现细胞表型随着患者年龄的增长而恶化，主要包括细胞核形状异常增加、孕激素积累和异染色质丢失。此外，通过不同的技术测定，HGPS细胞核中的转录分布发生了改变。为了改善细胞表型，我们应用了影响蛋白质法尼酰化或染色质排列的药物进行治疗。我们的结果表明，美维诺林和组蛋白去乙酰化酶抑制剂曲古抑菌素A的联合治疗显著降低了前体蛋白水平，导致HGPS成纤维细胞异染色质组织的修复和转录物的重组。这些结果表明，HGPS细胞核的形态功能缺陷与前体蛋白的积累直接相关，可以通过药物治疗加以纠正。

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数字

图1
图1
HGPS成纤维细胞的核缺陷。(A类)HGPS成纤维细胞层粘连蛋白的Western blot分析。层粘连蛋白A和C在细胞株HGADFN003（第13代）和HGADFN227（第7代）中均以正常水平表达，而层粘连素A和C的水平在细胞株HGADFN001（第13届）中均降低。在所有检查的细胞裂解物中均检测到孕激素（67kDa），在老年患者细胞系HGADFN001中，相对于成熟层粘连蛋白A的比例增加。HGPS细胞中的emerin水平没有改变。分子量标记以kDa表示。每个患者的年龄显示为（y，年），细胞传代的数量显示在下一行（p，传代）。(B类)使用抗层粘连蛋白A/C（绿色）和抗emerin抗体（红色）进行IF分析，检测一个对照细胞系和三个HGPS细胞系（HGADFN003、HGADFN227和HGADFM001；详细信息见材料和方法）。HGPS成纤维细胞核形态发生改变，核膜内陷明显。Emerin主要与层粘连蛋白A/C共定位。较老细胞系中的核形状异常增加。(C类)对照核和HGPS核的超微结构分析（HGADFN003、HGADFN227和HGADFC001；详见材料和方法）。HGADFN127细胞50%的细胞核内陷明显，HGADFFN003和HGADADFN001细胞内陷频率增加。在所有HGPS细胞系中均观察到异染色质丢失，HGADFN0001细胞核中完全没有异染色素区域。核内陷包括外核膜（箭头）或选择性地累及内核膜和椎板（包括核周池，箭头）。(D类)畸形核的定量显示B类显示至少五个内陷的核被视为内陷核（左栏）。至少20%的对照核的大直径增大的核被视为增大核（右栏）。每个细胞系有1000个细胞核得分（详见图例）。进行了三酸盐染色实验（层粘连蛋白A/C-emerin染色）。计算平均值（包括平均值的标准误差），并将其报告为计数细胞核的百分比。
图2
图2
对照组和HGPS成纤维细胞中甲基化H3组蛋白物种的免疫荧光标记。H3K9标记采用特异性抗体，FITC-结合二级抗体（绿色）显示；用多克隆抗体标记层粘连蛋白A/C，用Cy-3结合二级抗体（红色）显示；DNA用DAPI复染；单H3K9标记（A）；di-H3K9标记（B）；tri-H3K9标记（C）。在HGADFN127成纤维细胞中进行的代表性实验如图所示。右侧报告了每个面板中显示的H3K9染色定量。条形图显示荧光强度降低的细胞核的平均百分比。荧光强度降低的核被认为是在对照核中测量到的平均荧光强度小于50%的核（使用Lucia Image 4.61版软件测量每个区域的荧光强度）。计算每个患者细胞系中进行的三次计数的平均值（详见图例），包括平均值的标准误差。
图3
图3
药物治疗的HGPS成纤维细胞层粘连蛋白的WB分析。对对照组和HGPS成纤维细胞进行药物处理，通过SDS-PAGE进行裂解和蛋白质分离。使用抗层粘连A/C或抗emerin抗体进行免疫印迹。（A） 未经处理的对照组成纤维细胞显示出几乎无法检测到的前层粘连蛋白A数量（第1道）。未经处理的HGPS成纤维细胞显示出少量野生型前层粘连蛋白a和大量前体蛋白（第3条线）。在所有受检细胞系（第2和第4道）中加入甲长春花碱后，观察到前层粘连蛋白A水平升高。甲维诺林处理的HGPS细胞（第4区）中前体蛋白的数量减少。(B类)TSA的进一步治疗导致野生型前层粘连蛋白a水平略有降低（第5、8车道），而前叶素水平显著降低（第8车道）。TSA治疗（在没有美维诺林的情况下）略微增加了对照组（第6通道）和HGPS细胞（第9通道）的层粘连蛋白A/C水平，但对前体蛋白水平影响最小（第9车道）。通过将5-氮杂脱氧胞苷（5-AC）添加到甲维诺林处理的对照组（第7道）和HGPS细胞（第10道）中，野生型前层胺A减少。进展蛋白的数量不受5-AC（第10车道）的影响。5-AC（车道7和10）对椎板层A/C水平的影响最小。对照组或HGPS细胞系中的Emerin未被药物治疗改变。肌动蛋白带被标记为加载控件。一个典型的实验是在每个对照细胞和HGPS细胞系中进行的三个不同的实验。(C类)前层粘连蛋白A和前体蛋白免疫印迹条带的密度分析A类和B类.前层蛋白A值是指在甲维诺林处理的细胞中检测到的前层蛋白A-量的百分比；前体蛋白值是指未经处理的HGPS细胞中检测到的前体蛋白含量的百分比。数值是在HGADFN001细胞中进行的三个独立实验的平均值的平均值±标准误差。
图4
图4
美维诺林/TSA处理的HGPS成纤维细胞中的异染色质组织。(A–D)实验是在每个细胞系中进行的三个独立分析的代表，图片是通过透射电子显微镜获得的。(A类)在未经处理的对照核的核外围，除核孔外，异染色质区很明显（*）。在未经处理的HGADFN001细胞核中，外周异染色质缺失。(B类)甲维诺林处理诱导对照细胞和HGPS细胞异染色质区的形成。HGADFN001细胞核中显示异染色质区域的细胞核百分比增加了5%。(C类)TSA处理并没有显著改变对照组或HGPS细胞中异染色质区的细胞核数量。(D类)美维诺林联合TSA治疗轻微影响对照组成纤维细胞的异染色质组织，同时将HGADFN001细胞核显示异染色素区域的百分比提高到40%。(E类)HGADFN001成纤维细胞细胞核中tri-H3K9和层粘连蛋白A/C的双IF染色。FITC-偶联二抗（绿色）显示抗tri-H3K9抗体；通过Cy3偶联的第二抗体（红色）揭示了抗层粘连蛋白A/C抗体。Tri-H3K9标记对照核（对照）的离散病灶，而36%的HGPS核（HGPS）的标记丢失。美维诺林处理（Mevinolin）不影响tri-H3K9阳性对照细胞的数量，而略微增加了tri-H3K9阳性HGPS细胞的数量。TSA处理（TSA）影响了对照细胞中tri-H3K9病灶的分布，但对HGPS细胞无效。在HGPS细胞核中，经美维诺林+TSA处理（美维诺林/TSA）后，tri-H3K9标记完全恢复。（F） 面板A-D中显示的电子显微镜分析定量。报告了对照组和HGADFN001成纤维细胞中至少显示四个异染色质区域的细胞核百分比。（G） 每次药物治疗前后HGADFN001成纤维细胞中tri-H3K9阳性核的定量（如图所示E类). 计算了三次试验的平均值，包括平均值的标准误差。每个样品计数1000个核。
图5
图5
HGPS细胞核中的转录物分布发生改变。(A类)原位转录分析显示，对照细胞核中BrU染色均匀（200个计数细胞核中的91%），在放大的HGADF001细胞核中，转录活性降低，BrU分布不均匀（200多个计数核中的41%）。美维诺林/TSA处理后，在HGPS细胞核中观察到均匀的BrU染色（200个计数细胞核中的83%）（右栏）。包含BrU的RNA转录物用抗BrU抗体标记，并用Cy-3结合二级抗体（红色）显示。用抗层粘连蛋白A/C抗体标记核膜，用FITC-偶联二级抗体（绿色）显示核膜。合并图像（合并）强调了BrU在对照核和HGPS核中的不同分布。通过荧光显微镜获得图像。（B） 对照组和HGADFN001细胞核的EDTA反向染色。在对照核中，在核内部观察到电子密度高的核糖核蛋白簇，而外围漂白的异染色质被检测到是未染色的区域（箭头）（200个观察到的核中有96%）；在美维诺林/TSA处理的对照组（200个观察到的细胞核中的74%）的整个细胞核中观察到EDTA染色。在未经处理的HGPS细胞核中，观察到弥漫的灰色染色，电子密度的核糖核蛋白减少（200个观察到的细胞核中有36%）（核膜的不规则厚度用箭头表示）；在mevinolin/TSA处理的HGPS细胞核中，核糖核蛋白染色得到恢复，核周边（箭头）检测到漂白的异染色质区域（在200个观察到的细胞核中，有87%）。矩形区域内可见不同的核糖核蛋白染色模式；通过透射电子显微镜拍摄图像。(C类)2H10抗体标记的核内层粘连蛋白A的标记模式对应于斑点分布（对照）（200个观察到的细胞核中的95%）；美维诺林/TSA治疗对大多数对照细胞核的2H10标记没有影响（在200个观察到的细胞核中有76%）；层粘连蛋白A 2H10在HGADFN001细胞核内不规则分布的病灶中染色（HGPS，未处理）（200个观察到的细胞核中有53%）；用甲长春花碱/TSA（HGPS，甲长春花素/TSA）处理HGPS细胞，可获得与对照细胞核相当的染色模式（在200个观察到的细胞核中，81%）。对每个HGPS细胞系进行了三次重复的代表性实验。
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