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.2005年11月；25(21):9292-303.
doi:10.1128/MCB.25.21.9292-9303.2005。

UBL-UBA蛋白KPC2在细胞周期G1期p27降解中的作用

太极原野 1, Takumi Kamura公司, Shuhei Kotoshiba公司, 高桥秀久, 藤原贤一郎, 小野一郎, 白川正弘, Noboru水岛, 中山庆一
附属公司

UBL-UBA蛋白KPC2在细胞周期G1期p27降解中的作用

太极原野等。 分子细胞生物学. 2005年11月.

摘要

KPC2（Kip1泛素化保护复合物2）与KPC1共同形成泛素连接酶KPC，调节细胞周期G（1）期细胞周期依赖性激酶抑制剂p27的降解。KPC2包含一个泛素样（UBL）结构域、两个泛素相关（UBA）结构域和一个热休克伴侣蛋白结合（STI1）结构域。我们现在证明KPC2通过其UBL结构域与KPC1相互作用，通过其UBB和NH（2）末端UBA结构域与26S蛋白酶体相互作用，并通过其UBA结构区与多泛素化蛋白质相互作用。KPC2与KPC1的结合被发现以依赖于KPC2的STI1结构域的方式稳定KPC1。缺少NH（2）末端或COOH末端UBA结构域的KPC2突变体在体外支持p27的多泛素化，而缺少STI1结构域的KPI2衍生物在这方面受到了极大损害。RNA干扰对KPC2的耗竭导致抑制p27在G（1）期的降解，将KPC2衍生物引入KPC2-depleted细胞表明KPC2的NH（2）末端UBA结构域对p27降解至关重要。这些观察结果表明，KPC2与KPC1协同调节p27降解，KPC2的STI1结构域以及UBL和UBA结构域对其功能不可或缺。

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数字

图1。
图1。
KPC2的结构。（A） 人类KPC1和KPC2以及hHR23B和hPLIC1的域组织。（B） 人类KPC2（残基14至96）和hHR23B（残基1至79）UBL结构域氨基酸序列的比对。图中显示了相同（黑色）和类似（灰色）氨基酸。指出了hHR23B UBL结构域的二级结构元素。星号表示hHR23B中对与S5a的COOH末端泛素相互作用基序相互作用很重要的残基。（C） 人类KPC2和hHR23B的UBL结构域模型（蛋白质数据库代码1UEL）。hHR23B残基的侧链对结合到S5a的COOH末端泛素相互作用基序很重要，如图所示。使用Modeller程序建立了KPC2 UBL域的模型结构。对关键氨基酸进行标记和编号。
图2。
图2。
KPC2与蛋白酶体的相互作用。（A） 凝胶过滤色谱上KPC2与蛋白酶体亚基的共溶。NIH 3T3细胞在10μM MG132或载体存在下孵育6 h，裂解并通过凝胶过滤柱色谱分离。用KPC2、19S蛋白酶体复合体的S10或S12亚单位以及20S蛋白酶体的核心α亚单位（亚单位1、2、3、5、6和7）的抗体对所得组分（以及细胞裂解物[lane L]）进行免疫印迹分析。标记蛋白（甲状腺球蛋白669kDa；铁蛋白440kDa、牛血清白蛋白67kDa和核糖核酸酶A 13.7kDa）的洗脱位置和空隙体积(V（V）o个)显示。（B） 19S蛋白酶体复合物S5a亚单位与KPC2的共免疫沉淀。将HEK293T细胞在有无MG132的情况下（左、右面板）孵育4 h，裂解，并用KPC2兔抗体或对照兔IgG进行免疫沉淀（IP）。用抗KPC1、KPC2、S5a和糖原合成酶激酶-3β的抗体（内部对照）对所得沉淀物进行免疫印迹分析。一部分（1%）的输入裂解物也用相同的抗体直接进行免疫印迹分析。（C） S12和KPC2的免疫共沉淀。如图所示，用编码KPC2（标记有三个FLAG表位）或S12（标记有HA表位）的表达质粒转染HEK293T细胞。然后将其与MG132孵育4 h，裂解，并用FLAG或HA抗体进行免疫沉淀。用相同的抗体对产生的沉淀物进行免疫印迹分析。一部分（1%）的输入裂解物也直接进行免疫印迹分析。（D） S10与KPC2的各种突变体的共免疫沉淀。表达所示三种FLAG标记KPC2衍生物或转染空载体（Mock）的HEK293T细胞与MG132孵育4 h，裂解，并用FLAG抗体进行免疫沉淀。用S10或FLAG抗体对所得沉淀物进行免疫印迹分析。一部分（1%）的输入裂解物也用相同的抗体直接进行免疫印迹分析。IB，免疫印迹；IP，免疫沉淀。
图3。
图3。
KPC2的UBA结构域在与多泛素化蛋白结合中的作用。（A） KPC2衍生物与多泛素化蛋白质的体外结合。野生型KPC2或其突变体的GST和GST融合蛋白与HeLa细胞的S100组分在4℃孵育2 h，然后用谷胱甘肽珠沉淀。用多泛素或GST抗体对珠结合材料进行免疫印迹分析。S100部分也直接进行免疫印迹分析。（B） KPC2衍生物与多泛素化蛋白质的体内结合。用标记有三个FLAG表位的野生型或突变型KPC2质粒转染的HEK293T细胞与MG132孵育4 h，裂解，并用FLAG抗体进行免疫沉淀。用多泛素或FLAG抗体对产生的沉淀物进行免疫印迹分析。一部分（1%）的输入裂解物也用相同的抗体直接进行免疫印迹分析。IB，免疫印迹；免疫沉淀；聚Ub，聚泛素化。
图4。
图4。
通过与KPC2的相互作用稳定KPC1。（A） 用凝胶过滤柱色谱分离HEK293T细胞裂解物，并用KPC1或KPC2抗体对所得组分进行免疫印迹分析。星号表示与KPC2抗体交叉反应的蛋白质的位置。（B） HEK293T细胞裂解物用KPC1或KPC2抗体或对照IgG进行免疫沉淀，所得沉淀物（以及1%的输入裂解物）用KPC1和KPC2抗体进行免疫印迹分析。星号表示与KPC1抗体交叉反应的蛋白质的位置。（C） 用环己酰亚胺（50μg/ml；CHX）处理稳定表达KPC1（标记有FLAG表位）且带有或不带有KPC2（标记有HA表位）的NIH 3T3细胞指定时间，然后用FLAG、HA或HSP90抗体对细胞裂解液进行免疫印迹分析（对照）。（D） 从NIH 3T3细胞制备的裂解物稳定表达KPC2 mRNA或EGFP mRNA特异性shRNAs（对照），用KPC1、KPC2或HSP70抗体进行免疫印迹分析（对照）。星号表示与KPC1抗体交叉反应的蛋白质的位置。（E） 表达所示三种FLAG标记的KPC2衍生物的HEK293T细胞裂解液用FLAG抗体免疫沉淀，所得沉淀用KPC1或FLAG抗体进行免疫印迹分析。输入裂解物的一部分（1%）也用相同的抗体直接进行免疫印迹分析。免疫球蛋白L（左），免疫球蛋白轻链。（F） 表达KPC2或EGFP shRNAs的NIH 3T3细胞被编码所示人类KPC2衍生物（标记有HA表位）的逆转录病毒载体或相应的空逆转录病毒（Mock）感染。随后用KPC1、HA、KPC2或HSP70抗体对细胞裂解物进行免疫印迹分析（对照）。星号表示与KPC1抗体交叉反应的蛋白质的位置。（G） 用KPC1载体（标记有FLAG表位）和野生型（WT）KPC2、KPC2（ΔSTI1）或KPC2（△UBL-SI1）载体转染HEK293T细胞，每种载体都标记有HA表位或相应的空载体（Mock）。用FLAG或HA抗体对细胞裂解物进行免疫沉淀（IP），并用相同的抗体对所得沉淀物（以及1%的输入裂解物）进行免疫印迹分析（上图）。或者，转染细胞被标记为[35S] 蛋氨酸1小时，清洗并孵育指定的追逐期，之后用FLAG抗体对细胞裂解物进行免疫沉淀，并通过十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳和放射自显影术分析所得沉淀物（左下方）。The intensities of the35S标记的KPC1条带通过扫描密度测定法进行定量（右下方）。IB，免疫印迹。
图5：。
图5：。
KPC2突变体对体外p27泛素化的影响。检测KPC1和KPC2衍生物的重组复合物在Uba1、UbcH5A、GST-泛素和ATP存在下介导p27多泛素化的能力。用p27或GST抗体对反应产物进行免疫印迹（IB）分析（上两张图）。底部面板显示反应中使用的重组KPC1（标记有FLAG表位）和KPC2衍生物（标记有HA表位）数量的免疫印迹分析。野生型；GST-Ub、GST-泛素。
图6。
图6。
KPC2对p27降级的要求。（A） RNA干扰导致KPC2缺失对p27降解的影响。稳定表达KPC2或EGFP shRNAs的NIH 3T3细胞在G0分阶段接触抑制和血清剥夺，然后通过在～40%的密度下重放并在完全培养基中孵育指定时间来刺激重新进入细胞周期。然后用p27或HSP70抗体对细胞裂解物进行免疫印迹分析（左面板）。p27条带的强度被量化并绘制出来（右侧面板）。（B） 通过引入人KPC2衍生物补充表达小鼠KPC2 shRNA的NIH 3T3细胞中受损的p27降解。表达KPC2或EGFP shRNAs的NIH 3T3细胞被所示人类KPC2衍生物的逆转录病毒载体（标记有HA表位）或相应的空逆转录病毒（Mock）感染。然后检测细胞在G期的p27降解情况1如图A.IB，免疫印迹。
图7。
图7。
KPC2在调节p27降解中的作用。本研究中产生的KPC2缺失突变体的示意图。KPC2包含一个UBL结构域（残基14到96）、两个UBA结构域（残留基196到230和289到325）和一个STI1结构域（残余基352到391）。检测KPC2衍生物（i）与蛋白酶体、多泛素化蛋白质和KPC1结合能力的实验结果；（ii）支持p27泛素化；和（iii）总结了表达KPC2 shRNA的NIH 3T3细胞中KPC1的失稳或p27降解的损害。ND，未确定。
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参考文献

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