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.2005年11月；25(21):9198-208.
doi:10.1128/MCB.25.21.9198-9208.2005。

哺乳动物lin-28基因在胚胎癌细胞神经分化过程中的微RNA调控

吴立刚 1, 乔尔·贝拉斯科
附属公司

哺乳动物lin-28基因在胚胎癌细胞神经分化过程中的微RNA调控

吴立刚等人。 分子细胞生物学. 2005年11月.

摘要

脊椎动物基因组每一个都编码数百个micro-RNA（miRNAs），然而对于这些microRNAs中的很少一部分，有经验证据表明它们调控着哪些mRNA。在这里，我们报告了人类lin-28 mRNA作为人类miR-125b及其同源物miR-125a的调节靶点的鉴定。对miR-125b在小鼠P19胚胎癌细胞中的功能的研究表明，这种调节性miRNA在哺乳动物神经元分化中发挥作用，因为其在这些细胞中的浓度增加有助于lin-28的下调。在lin-28 3'非翻译区（UTR）内有两个保守的miRNA反应元件（miRE），它们介导miR-125b和miR-125a的阻遏作用。同时缺失两个miRE使得lin-28 3'UTR对这些miRNAs几乎完全不敏感，表明这两个miREs是lin-28 3'UTR中对miR-125反应的主要元件。在每个元件的3'端有一个腺苷残基，无论其与miR-125的5'端核苷酸的互补性如何，它都对功能有重要贡献。与大多数早期报道的其他miRNAs对靶基因不完全互补的基因抑制相比，miR-125对lin-28的下调涉及翻译效率和mRNA丰度的降低。mRNA浓度的降低是通过转录后机制实现的，该机制与翻译的抑制作用无关。

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数字

图1。
图1。
人miR-125a和miR-125b。A.miR-125a、miR-125b和秀丽线虫lin-4miRNA。miRNAs以5′-3′方向（从左到右）绘制，并突出显示保守区域。B.转染细胞中miR-125a和miR-125b的丰度增加。用编码miR-125a或miR-125b的质粒（pMIR125a或pMIR1256b）或不编码miRNA的质粒缺失变体（pMIR 125aΔ或pMIR 125 bΔ）瞬时转染293T细胞。36 h后，提取总RNA并通过凝胶电泳和印迹分析，使用与miR-125a或miR-125b互补的放射性标记寡核苷酸探针。miR-125a和miR-125b的序列相似性导致了这两种探针的一些交叉杂交。miR-125a以双链形式迁移，表明两种形式的长度不同于一个核苷酸，可能表明3′末端加工位点的异质性（±a）。还检测到的较大RNA的大小表明，它们是miR-125a和miR-125b（前miR-125a和前miR-125 b）的部分处理的干环前体。与细胞提取物中的miRNAs和pre-miRNAs不同，用作近似大小标记（M）的寡核苷酸在5′端没有磷酸化，因此在电泳过程中迁移速度比其他情况慢。
图2。
图2。
荧光素酶报告子抑制第28行miR-125a和miR-125b的miRE。A.人类地图第28行mRNA和第28行miR-125a和miR-125b的miRE。在RNA双工体中，miRE（顶链）以5′-3′方向（从左到右）绘制，miRNA（底链）以3′-5′方向（由左至右）绘制。这两个第28行miREs直接相邻，因此miRE1的3′端和miRE2的5′端显示的两个核苷酸与第28行3英尺UTR。B.携带荧光素酶报告子的抑制第28行miR-125a和miR-125b的3′UTR。293T细胞与携带人类荧光素酶报告质粒的瞬时共转染第28行3′UTR（Luc-lin 28）或SV40晚期3′UTR-（Luc），以及编码β-半乳糖苷酶的质粒（控制转染效率的内部标准）和编码miR-125a或miR-125b、其缺失变体或无miRNA相关转录物的五种质粒之一（对照）。或者，使用已删除miRE1和/或miRE2的Luc-lin 28报告子进行共转染。36 h后，测量细胞提取物中荧光素酶活性与β-半乳糖苷酶活性的比值。误差条对应于多次测量的标准偏差。C.抑制携带多份荧光素酶报告子的第28行miR-125a和miR-125b的miRE。293T细胞与含有荧光素酶-SV40报告基因（Luc）的质粒瞬时共转染，该报告基因携带0、2、4或6个miRE1、miRE2或第28行其3′UTR中的元素X（UGCAAGUGGGGUUCGGGG），以及编码miR-125a或miR-125b或其缺失变体的四个质粒之一，以及编码β-半乳糖苷酶的质粒（内部标准）。36 h后，测量细胞提取物中荧光素酶活性与β-半乳糖苷酶活性的比值。然后将转染编码miR-125a或miR-125b基因的细胞的活性比率归一化为转染不编码miRNA的相应缺失突变体的细胞的比率并绘制图表。
图3。
图3。
中无响应或响应不良的元件第28行3英尺UTR。无反应或反应不良的假想双工第28行3′UTR元件（顶部绞线，5′至3′方向），带有miR-125b（底部绞线，3′至5′方向）。在转染293T细胞中，miR-125b介导翻译抑制的每种元素的相对效力计算如下(R（右）E类− 1)/(R（右）miRE1型−1），其中R（右）是携带该元素任意两个拷贝的报告者在没有miR-125b的情况下荧光素酶生成量（归一化为β-半乳糖苷酶活性）与存在miR-125a的比率(R（右）E类)或两份miRE1(R（右）miRE1型). 在所示的三种元素中，只有miRE0具有可检测到的抑制活性，其作用仅为miRE1的30%。
图4。
图4。
miRE1变异体抑制基因表达的功效。A.miRE1及其变体（上链）与miR-125b（下链）的复合体。这些双工体的两条链中的核苷酸是从右到左编号的。预期与miR-125b的5′部分形成连续碱基对的miRE核苷酸显示在每个双链旁边，以及miRE 3′端（位置1）的核苷酸的相同性。miRNA变体miR-125b-U1A（未显示）与miR-125b相同，但5′末端（位置1）的U→a替换除外。B.含有两个miRE1拷贝或其变体的荧光素酶-SV40报告基因的抑制。将293T细胞与编码报告基因mRNA的质粒、β-半乳糖苷酶（内标）和miR-125b、带有5′末端腺苷的miR-125b-U1A替代突变体或miR-125b-缺失突变体（miR-125aΔ）瞬时共转染。36 h后，测量细胞提取物中荧光素酶活性与β-半乳糖苷酶活性的比值。通过将缺乏miR-125b的细胞中的比率除以含有miR-125a（黑条）或miR-125b-U1A（灰条）的其他相同细胞中的比例，计算每个3′UTR元件的阻遏比率。然后将这些抑制比率绘制在对数刻度上。
图5：。
图5：。
翻译效率和mRNA丰度对miR-125a和miR-125b抑制的相对贡献。A.RNA印迹显示miR-125a和miR-125b对含有零或六个拷贝的报告基因mRNA的细胞浓度的影响第28行miRE1或miRE2。将293T细胞与一个报告基因、一个β-半乳糖苷酶基因和一个编码miR-125a（a）、miR-125b（b）的基因或一个相同的原转录物瞬时共转染，该原转录物中的前miRNA干环已被删除（Δ）。36 h后，利用补充荧光素酶mRNA和β-半乳糖苷酶mRNA的放射性标记探针（内标），通过凝胶电泳和印迹分离和分析细胞质RNA。B.翻译抑制和mRNA丰度降低对miR-125a和miR-125b抑制的贡献。将每个样本中的报告者mRNA浓度归一化为β-半乳糖苷酶mRNA的浓度，并计算转染miR-125a或miR-125b基因的细胞中报告者mRNA的归一化浓度与相应miRNA缺失变体的比值。为了揭示翻译效率（每个mRNA分子的蛋白质产量）和mRNA丰度对抑制基因表达的相对贡献，计算出的每个miRNA对含有六个miRE1或miRE2拷贝的报告mRNA细胞质丰度的影响叠加在一张图上，该图显示了每个miRNA抑制相同报告基因的总体程度。如图4所示，计算出了这种总体抑制程度，即抑制比。miRNA对翻译效率的影响（黑色条）对应于其对蛋白质合成的总体影响与其对mRNA丰度的影响（灰色条）的比率。在miRE1的情况下，miR-125a或miR-125b的表达分别使翻译效率降低4.3±0.3或2.9±0.4倍，mRNA丰度分别降低4.2±0.2或3.2±0.1倍。对于miRE2，miR-125a或miR-125b的表达分别使翻译效率降低3.8±0.4或2.2±0.3倍，mRNA丰度降低3.1±0.3或2.7±0.3倍。
图6。
图6。
在miRE上游插入多聚腺苷化位点的后果。A.荧光素酶报告基因上游六个拷贝的牛生长激素（BGH）多聚腺苷酸化信号完整（wt:AATAAA）或缺陷（mut:TTCTTT）第28行miRE1和miRE下游完整的SV40多聚腺苷化信号。B.miR-125b对报告基因表达的影响，在报告基因中，完整（wt）或缺陷（mut）BGH多聚腺苷化信号被插入到0或6个拷贝的上游3′UTR中第28行将miRE1.293T细胞与一个报告基因、一个β-半乳糖苷酶基因和一个编码miR-125b的基因或一个相同的原转录物瞬时共转染，该原转录物的前miRNA干环已被删除（miR-125b-Δ）。36 h后，测量细胞提取物中荧光素酶活性与β-半乳糖苷酶活性的比值。C.RNA印迹显示miR-125b对报告者mRNA细胞质浓度的影响，其中完整（wt）或缺陷（mut）BGH多聚腺苷酸化信号被插入六个拷贝的上游第28行miRE1.293T细胞瞬时共转染，如图5所示，36小时后，分离并分析细胞质RNA。与阴性对照（Δ=miR-125bΔ）相比，miR-125b（b）将含有缺陷多聚腺苷酸化信号的2.4-kb报告基因mRNA和六个miRE1拷贝的细胞质浓度降低至其未表达值的44%±4%，但不影响从miREs上游含有功能性多聚腺苷化信号的其他相同基因转录的1.8-kb mRNA的浓度（98%±7%）.
图7。
图7。
miR-125b下调mRNA丰度的翻译无关性。用荧光素酶报告基因瞬时共转染293T细胞，该报告基因在3′UTR中携带6个miRE1拷贝，在5′UTR、β-半乳糖苷酶基因和编码miR-125b（b）的基因中有或没有编码大干环结构的片段（CGGGGCGCGUGGGCGGCCUGCGCGCGCCGCCACACCGCCCGCGCCCG）或删除了前miRNA干环的相同的一级转录本（Δ）。36小时后，分离并分析细胞质RNA，如图5所示。报告者mRNA与β-半乳糖苷酶mRNA（内部标准）的比值显示在每条车道的底部。
图8。
图8。
miR-125a和miR-125b水平的变化以及第28行维甲酸诱导P19细胞分化后的基因表达。在存在或不存在视黄酸（1μM）的情况下，将P19细胞在琼脂糖包被的培养皿中生长5天。每天提取RNA和蛋白质样本，并通过印迹分析等量的样本，使用放射性标记DNA探针检测特定RNA（miR-125a、miR-125b和第28行mRNA）和多克隆抗Lin-28抗体检测Lin-28。tRNA、18S rRNA和肌动蛋白作为内部标准。Lane M，从瞬时转染pMIR125a（顶对面板；用miR-125a特异性探针检测）或pMIR1256b（第二对面板；使用miR-125b特异性探针进行检测）的293T细胞中提取的RNA；注意，诱导5天的P19细胞和转染的293T细胞中miR-125b的丰度相似。由于低水平交叉杂交，用miR-125a特异性探针可检测到miR-125b（微弱的下带），而用miR-125特异性探针则可检测到miR-125a（微弱的上带）。
图9：。
图9：。
下调第28行通过在未分化P19细胞中产生miR-125b来表达基因。将未分化P19细胞转染编码miR-125b的质粒（pSH-MIR125b，1.5μg）或缺失miR-125b基因片段（Δ）的其变体（pSHAG-1，1.5μg），两天后制备RNA和蛋白质提取物。或者，用维甲酸处理未转染的P19细胞（−）4天，1天后提取RNA。通过印迹法分析等量的每个RNA或蛋白质样品，以检测miR-125b、Lin-28蛋白和第28行mRNA。tRNA、18S rRNA和肌动蛋白作为内部标准。转染pSH-MIR125b的未分化P19细胞中miR-125b的生成增加降低了Lin-28蛋白的丰度第28行mRNA在对照细胞中的浓度（Δ）约为其各自浓度的四分之一（26%±2%）和二分之一（52%±2%。
图10。
图10。
miR-125b对分化P19细胞中Lin-28蛋白合成的影响。A.（Top）用于抑制其活性的miR-125b和互补的2′-O-甲基化寡核苷酸（2′OMe抗-miR-125b）的序列。还显示了用作阴性对照的非互补性2′-O-甲基化寡核苷酸的序列。（底部）2′OMe抗miR-125b寡核苷酸在抑制miR-125b功能方面的功效通过与荧光素酶-SV40报告基因的瞬时共转染未分化P19细胞而得到证实，荧光素素酶-SV 40报告基因在其3′UTR（25 ng）、编码miR-125c的质粒或其缺失变体（750 ng）中含有零或六个miRE2拷贝，编码β-半乳糖苷酶（25 ng，内标）的质粒，以及2′OMe抗miR-125b寡核苷酸或对照寡核苷酸（100 pmol）。48小时后，制备细胞提取物，并测量荧光素酶活性与β-半乳糖苷酶活性的比值。然后将转染含有六份miRE2的报告基因的细胞中的活性比率归一化为转染含有缺少该元素的相应报告基因的电池中的比率，并绘制比率图。B.未分化的P19细胞瞬时转染2′OMe抗miR-125b寡核苷酸或阴性对照2′OMe寡核苷酸（200 pmol），然后用维甲酸处理诱导分化。诱导后五天半，制备蛋白质提取物，并通过免疫印迹法分析等量的每个提取物，以检测Lin-28蛋白和肌动蛋白（内部标准）。与对照寡核苷酸相比，转染2′-O-甲基化抗miR-125b寡核苷酸使Lin-28蛋白合成增加了近2倍（1.8±0.3）。
图11：。
图11：。
的贡献第28行miRE抑制分化P19细胞的基因表达。A.用视黄酸处理过（+）或未处理过（-）的P19细胞与编码荧光素酶报告子的质粒瞬时共转染，该报告子与人融合第28行3′UTR（Luc-lin 28，0.05μg）、编码β-半乳糖苷酶的质粒（0.05μg，内标物）和pUC19（0.9μg）。或者，使用Luc-lin 28报告子进行共转染，其中对miR-125（miRE0、miRE1和miRE2）和/或let-7 miRNA（L7:GAGUGCACAGCCUAUUGAACUACCUCA）有反应的元件已被删除（参见人第28行mRNA）。36h后，制备细胞提取物，并测量荧光素酶活性与β-半乳糖苷酶活性的比值。在绘制图表之前，将比率标准化为缺少所有四个miRE的报告者的测量值。用编码荧光素酶-SV40报告基因mRNA的质粒和编码β-半乳糖苷酶的质粒（0.9μg，内标物）瞬时共转染B.P19细胞。12 h后，将细胞转移到培养皿中，并在含有胎牛血清（FBS）（10%）和维甲酸（1μM）的α-MEM中培养4天。然后将细胞转移到涂有聚乙烯的组织培养皿中-d日-赖氨酸，并在含有10%胎牛血清的α-MEM（允许非神经细胞生长）或含有B27补充剂的神经基底培养基（抑制非神经细胞的生长）中培养6天以上（4）。每隔2天制备细胞提取物，并测量荧光素酶活性与β-半乳糖苷酶活性的比率。然后将转染含有六份miRE1的报告者的细胞中的活性比率归一化为转染缺少这种miREs的报告者细胞中的比率，并将数据绘制成图表。
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