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.2006年2月；172(2):783-94.
doi:10.1534/genetics.105.047167。 Epub 2005年10月3日。

染色体传递保真度的SIZ1/SIZ2控制是由拓扑异构酶II的sumoyalization介导的

吉米通·高桥（Yoshimitsu Takahashi） 1, 弗拉基米尔·永格扎雷斯, 菊池义子, 亚历山大·斯特伦尼科夫
附属机构

染色体传递保真度的SIZ1/SIZ2控制由拓扑异构酶II的sumoylation介导

吉米通·高桥（Yoshimitsu Takahashi）等人。 遗传学. 2006年2月.

摘要

Smt3（SUMO）蛋白通过E1、E2和E3酶级联与底物蛋白结合。在芽殖酵母中，sumoylation的E3步骤主要由Siz1p和Siz2p控制。对Siz细胞的分析表明，SUMO E3是微小染色体分离所必需的，因此对保持遗传信息有丝分裂传递的保真度具有积极作用。Top2p羧基末端的Sumoylation是一个已知的SUMO靶点，在体内和体外均由Siz1p和Siz2p介导。体外Sumoylation表明Top2p是Smt3p结合的一种极为有效的底物，与许多其他SUMO底物不同，染色质结合的Top2p仍然可以进行sumoylated。通过结合TOP2 sumoylation位点以及SIZ1和SIZ2基因的突变，我们证明了Smt3p-E3缺陷细胞所特有的小染色体分离缺陷和双中心小染色体稳定是由这些细胞中缺乏Top2p sumoylion介导的。通过对Top2p-Smt3p融合的分析，表明Smt3p-修饰作为Top2p靶向着丝粒周围区域的信号的作用。我们提出了一个通过Smt3p修饰对Top2p着丝粒池进行正控制的模型，以实现高分离保真度。

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图1。
图1。
SUMO E3突变体的微染色体维持表型。（A） 尺寸−突变体破坏了小染色体的有丝分裂传递。在Siz中测定了YCplac111的稳定性+（BY4733）和Siz−（4bAS399）30°下的菌株，如材料 和 方法（B）Siz公司−突变体不会破坏无着丝粒质粒的有丝分裂传递。pAS255（复制型）、pRS426（2μORI）和pIA1（Flp）的稳定性−Siz中的2μ）质粒+（BY4733）和尺寸−（4bAS399）菌株在30°下测定，如材料 和 方法.
图2。
图2。
Top2p以SUMO E3依赖的方式被修饰。（A） 染色质结合的Top2p是一种sumoylation底物在体外。所有假定目标都有HA-标记。将1μl从酵母细胞BY4733/pYT1033（Top2）、BY4733 bp5（Pds5）、YPH499 bp1（Smc4）、YPH 499 bp2（Smc2）、YPHz 499 bp6（Brn1）、BY 4733 bp4（Ycs4）和YPH499bp5（Ycs5）纯化的染色质与反应混合物在37°下培养120分钟（incub.+），并用抗HA抗体进行免疫印迹。将冰上保存的相同反应混合物（incub.−）用作阴性对照。（B） 净化Top2p由Smt3p修改在体外共4.4μg纯化Top2p（V奥恩 等。2005年）受到苏美化在体外（包括+）或留在冰上（包括−）（参见材料 和 方法)在37°下放置60分钟。用抗Top2p抗体进行免疫印迹。（C） Smt3p修饰的Top2p仍然与染色质密切相关。Top2p在染色质上下文中被修饰在体外如中所述材料 和 方法模拟反应（Smt3−）是在没有重组Smt3p的情况下进行的。IN，萃取前反应。用EBX或EBX+0.5在4°下对sumoylation反应后的Top2p进行萃取30分钟米NaCl缓冲液。通过离心分离染色质（P）和可溶性组分（S），并通过Western blotting进行分析。Top2p–Smt3p共轭词用星号标记。（D） Top2p由Smt3p修改在体外共有5μl来自BY4733/pYT1033（Top2）或BY4733/pYT1051（Top2-Smt3）的染色质与在体外磺酰化反应混合物（参见材料 和 方法)37°放置60分钟，并用抗HA抗体进行免疫印迹。sumoylation引起的特征迁移率偏移对应于Smt3p融合产生的偏移。Top2p–Smt3p缀合物用星号标记。（E） Top2p的COOH末端一致性sumoylation位点是Smt3p结合的主要靶点在体外将含有5μl染色质的反应混合物（从酵母细胞BY4733/pYT1033（Top2）和BY4733/pYT1022（Top2-SNM）中纯化）在37°下培养60分钟，并用抗HA抗体进行免疫印迹。（F） Top2p–Smt3p共轭在体外受SUMO E3刺激。来自4bAS399/pYT1033（Siz−)与在体外磺酰化反应混合物（参见材料 和 方法)37°放置60分钟，并用抗HA抗体进行免疫印迹。使用以下蛋白质和辅因子的组合：E1，4.5μg Uba2p，5.2μg Aos1p；E2，0.75μg Ubc9p；E3，4.5μg Siz1pΔ440; ATP（10 mM）和2.9μg的6xHis–Smt3p。未修改的Top2p带用“u”表示。Top2p–Smt3p共轭物用星号表示。只有在Smt3p存在的情况下，Top2p才能形成多种修饰形式。
图3。
图3。
Top2p尾部已修改体内以SUMO E3依赖方式。（A） Top2p的COOH末端区域和共识的sumoylation位点在酵母物种中的保守性有限。这个酿酒酵母Top2p尾部区域（残基1219–1428）与白色念珠菌(重心。)和棉蚜Ashbya gossypii(A.g.（美国）。)拓扑异构酶II和二级结构是使用JPred软件包（C乌夫和B阿顿2000). h、 α螺旋；e、 β-表。SUMO共识站点用开放框标记并编号。概述了受体赖氨酸残基。（B） 细胞生长不受标记的干扰前2名等位基因ΔC和3KR。野生型过夜培养的十倍系列稀释液(顶部2，顶部2：HA）和不同前2名在YPD平板上发现突变体，并在指定温度下培养。标记的排名前2等位基因替换菌株（W303-1A/pYT1033、W303-1A/pYT1024和W303-1A/pYT1035）经质粒转化后产生，如材料 和 方法也产生了相应的GFP标记菌株（YPH499/pYT1026、YPH499/pYT10207和YPH499%/pYT1028），并且对细胞增殖或Top2p核定位没有干扰（数据未显示）。Top2p琥珀酰化的（C和D）Western blot分析体内菌株924-YPH499的提取物（尺寸+)或924-4bAS399（Siz−)表达HF-Smt3p的生理水平并携带不同的前2名等位基因通过IMAC进行分离。FT，流量；EL，洗脱液。野生型排名前2基因和所有前2名对等位基因进行HA标记。使用抗FLAG（C）和抗HA（D）抗体通过Western blotting分析从色谱柱中洗脱的HF–Smt3p结合物。Top2p的共轭形式（仅存在于Siz+ 排名前2单元格）用星号表示。
图4。
图4。
Smt3p结合缺陷top2突变和SUMO E3缺陷在控制小染色体稳定性中的上位相互作用。（A） pRS415微染色体的传递效率。测量了微小染色体的稳定性（参见材料 和 方法)野生型（BY4733）为30°尺寸1/尺寸2突变株（4bAS399）前2名变体（pYT1033、pYT103或pYT105）。（B） SUMO E3突变体和前2名Smt3p结合缺陷突变稳定双中心小染色体。pAS72是一种条件双心室微染色体，在30°下在野生型（BY4733）和尺寸1/尺寸2（4bAS399）菌株前2名如中所述的变体（pYT1033、pYT103或pYT105）材料 和 方法.
图5。
图5。
组成性sumoyalization导致Top2p的中心周围靶向。（A） 之间的合成相互作用表面贴装4-Δ和排名前三：SMT3融合。相同浓度（106将三种菌株的培养物以10倍的连续稀释液涂布在YPD平板上，并在30°（允许表面贴装4-Δ）和37°（不允许表面贴装4-Δ）48小时的温度。集成排名前2变体产生Top2p–HA融合。SMT4顶部2：具有野生类型的W303SMT4型pYT1033基因转化。smt4顶部2和smt4顶部2以下为：SMT3型W303带有表面贴装4缺失，分别用pYT1033或pYT1051转化。作为表面贴装4-Δ导致大量死亡，即使在允许的温度下，与Smt4相比，起始稀释液具有不同数量的生长菌落+（B）用于Top2p结合的ChIP分析的PCR探针布局欧洲标准化委员会4区域。（C） Smt3p融合到Top2p尾部导致Top2p在欧洲标准化委员会4端粒周围区域。pYT1033转化W303菌株(排名前2：HA），pYT1051(排名前2以下为：SMT3型：HA）或pYT1035(排名前2-ΔC:HA），全部替代野生型顶部2使用B中显示的PCR探针对基因进行ChIP分析。ChIP分析如所述（S特伦尼科夫 等。2001年；W公司英国 等。2004年）。（D–F）Smt3p融合改变了Top2p–GFP在细胞核中的定位。Spc42p-mRFP用于标记表达野生型Top2p和相应Top2p–GFP融合的二倍体菌株中的SPB：排名前2以下为：SMT3型：GFP（D和E显示最大分辨率）和排名前2-ΔC:GFP（E）。将20个间距为0.2-μm的光学Z截面组合成图像（2×2分格，每帧曝光1秒，E除外：无分格，每帧曝光3秒）。箭头指向有丝分裂细胞中聚集的Top2p–Smt3p–GFP染色。
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