Histone H3 tail positioning and acetylation by the c-Myb but not the v-Myb DNA-binding SANT domain

doi:10.1101/gad.355405

.2005年10月15日；19（20）：2447-57。

doi:10.1101/gad.355405。 Epub 2005年9月29日。

c-Myb而非v-Myb DNA-结合SANT结构域对组蛋白H3尾部定位和乙酰化

莫显明（Xianming Mo）¹, 伊丽莎白·科文兹·勒茨, 伊夫·劳蒙尼尔, 洪旭, 洛伊茨

附属公司

PMID： 16195416
预防性维修识别码：项目经理1257399
内政部： 10.1101/编号355405

c-Myb而非v-Myb DNA-结合SANT结构域对组蛋白H3尾部定位和乙酰化

莫显明（Xianming Mo）等。基因开发. 2005.

.2005年10月15日；19(20):2447-57.

doi:10.1101/gad.355405。 Epub 2005年9月29日。

作者

莫显明（Xianming Mo）¹, 伊丽莎白·科文兹·勒茨, 伊夫·劳蒙尼尔, 洪旭, 洛伊茨

附属

¹德国柏林，13092，Max-Delbrueck-Center for Molecular Medicine。

PMID： 16195416
预防性维修识别码：项目经理1257399
内政部： 10.1101/编号355405

摘要

c-Myb转录因子协调造血前体细胞的增殖和分化。Myb有三个连续的N末端SANT-型重复域（R1、R2、R3），其中两个（R2、R4）形成DNA-结合域（DBD）。R2中的三个氨基酸替换改变了Myb调节基因的方式，并决定了逆转录病毒转导的v-Myb癌基因的致白血病性。这些突变如何释放Myb致白血病潜能的分子机制尚不清楚。这里我们证明c-Myb-DBD与H3和H3.3的N末端组蛋白尾部结合。C-Myb结合促进组蛋白尾部乙酰化，这在与CCAAT增强子结合蛋白（C/EBP）共同激活流行分化基因期间是必需的。v-Myb中的致白血病突变消除了与H3的相互作用和H3尾部的乙酰化，并消除了内源性分化基因的激活。在原代v-myb转化的成髓细胞中，H3乙酰化的药理学增强恢复了分化基因的激活并诱导了细胞分化。我们的数据将c-Myb的一种新染色质功能与分化基因的谱系特异性表达联系起来，并将这种功能的丧失与Myb的白血病转化联系起来。

PubMed免责声明

数字

**图1。**
C-Myb-DBD与组蛋白H3尾部相互作用。(A类)结合基质的GST-c-Myb-DBD经过纯化、重组的人类组蛋白处理，如顶部广泛清洗珠子，对结合蛋白进行SDS-PAGE并通过银染色显示。(B)如图所示，GST-组蛋白H3.3片段（氨基酸1-42和42-136）或GST对照物与体外培养³⁵S-蛋氨酸标记的c-Myb-DBD。对特异结合蛋白进行SDS-PAGE并通过荧光成像显示。(C)相似性绑定，如中所示B使用由H2A、（氨基酸1-35）、H2B（氨基酸1-36）、H3（氨基酸1-46）、H4（氨基酸1-34）或H3.3（氨基酸1-42）组成的GST-组蛋白尾部（人类）构建物。(D类)c-Myb与各种GST-组蛋白H3尾部结构结合的比较。底部面板（GST蛋白）B-D类显示如上所示结合实验中使用的GST结构的考马斯染色。输入表示用于下拉分析的材料的15%。

**图2。**
Myb-DBD和H3尾部绑定的配置。(A类)Myb构造概述和H3绑定数据摘要，如所示B和C. (B)在vitro-translated中，³⁵S-蛋氨酸标记的c-Myb（N-和c-末端截短，氨基酸80-497）或v-Myb与基质结合的GST-组蛋白尾部或GST孵育，作为对照。(上部面板）通过SDS-PAGE和荧光照相术显示特定结合蛋白。GST面板显示与GST控制的非特定结合，输入面板代表用于下拉分析的标记材料的15%。底部面板显示GST-H3和GST的蛋白染色，如图所示。(C)各种类型的下拉³⁵GST-H3标记的S-蛋氨酸Myb-DBD蛋白。基质结合的GST融合蛋白与体外翻译的标记Myb-DBD突变体孵育。输入表示用于下拉分析的标记材料的15%。

**图3。**
Myb的靶基因结合独立于H3尾部结合。(A类)mim-1和溶菌酶基因的示意图表示，指示扩增产物（灰色条）、TATA盒、转录起始位点（+1）和转录终止位点的位置。(B)将截短的c-Myb蛋白（氨基酸80-497）、c-Myb的氨基酸替代突变体或载体对照转染到QT6成纤维细胞。细胞裂解产物用ChIP和抗Myb抗体进行分析，共免疫沉淀DNA经PCR扩增，电泳分离，显示为溴化乙锭染色凝胶的阴性图像。输入车道(降低面板）表示IP所用材料的0.1%。Myb构建如图2A所示。(C)与中相同B使用v-Myb和v-Myb的突变体。

**图4。**
c-Myb和v-Myb蛋白独立于H3尾部结合向染色质嵌入启动子募集p300。(A类)C-Myb和v-Myb蛋白或C-Myb或v-Myb突变体与HA标记的p300一起转染到QT6成纤维细胞。用抗HA抗体免疫沉淀染色质。共沉淀DNA通过PCR扩增进行分析。图中显示了溴化乙锭染色凝胶的负像。(下部面板）输入通道代表IP所用材料的0.1%。(B)Myb和p300表达和IP控制。v-Myb蛋白与p300在QT6成纤维细胞中表达。(左侧)IP与HA或免疫前血清样本通过SDS-PAGE分离、印迹，并通过抗Myb免疫染色显示。SDS-PAGE分离蛋白和印迹蛋白的细胞裂解物对照显示转染Myb和p300蛋白的表达。

**图5。**
在Myb靶基因上H3 K18和K23的乙酰化依赖于H3尾部结合和Myb招募p300。(A类)将载体控制或c-Myb蛋白及其突变体转染到QT6细胞中(左边)或与一起(*正确的*)300页，如顶部染色质通过针对乙酰化H3 K18或K23的抗体进行免疫沉淀，如左边共沉淀DNA通过PCR扩增进行分析。图中显示了溴化乙锭染色凝胶的负像。输入通道代表IP所用材料的0.1%。(B)从一只1日龄的鸡中分离出骨髓细胞，并感染编码截短c-myb或myb-DBD突变体的重组病毒，如*正确的*（逆转录病毒结构表示ChIP分析的通道）和Introna等人（1990年）。转化的成髓细胞在适当的条件下扩增，并根据*正确的*.

**图6。**
Myb-DBD决定嵌合C/EBPβ-Myb结构域交换蛋白中H3尾乙酰化和基因激活。(A类)构件的示意图。C/EBPβ具有N末端SWI/SNF招募和反式激活域（βN，氨基酸1-116）、中央调控域（RD）和C末端b-Zip域。Myb-DBD显示为黑框。R2和R3 Myb重复序列显示为三角形（白色和灰色三角形分别表示c-Myb和v-Myb DBD），v-Myb突变显示为黑点。C-Myb或v-Myb（TAD）的C末端反式激活片段被描述为白色和灰色方框。嵌合结构由C/EBPβN末端（βN）在框架中与Myb融合构成。嵌合Myb蛋白由c-Myb（βN-c-c）或v-Myb（？N-v-v）或结构域交换（？N-c-v；？N-v-c）组成，如图所示。(*B、上部*面板）所示的融合蛋白在存在³⁵如图所示，S-蛋氨酸与或不与（+/-）混合在体外翻译的血凝素HA标记的hBrm（无放射性标记）中。用HA特异性抗体（αHA-IP，如顶部)SDS-PAGE和荧光显示。输入通道代表IP所用材料的10%。(下部小组）SDS-PAGE分离蛋白和印迹蛋白的细胞裂解物对照，以显示嵌合蛋白的表达。(C)如图所示，编码嵌合蛋白的表达载体与辅激活剂或其组合一起转染，如图顶部使用HA、p300或乙酰化H3抗体进行ChIP，如左边通过PCR扩增分析包含mim-1启动子的共沉淀DNA。图中显示了溴化乙锭染色凝胶的负像。输入通道代表IP所用材料的0.1%。(D类)编码嵌合蛋白的表达载体，如A类或对照组（c-myb+c/EBPβ，载体，c-myb，c/EBP？，v-myb）转染QT6成纤维细胞。24小时后采集RNA，并用*最小值-1*随后以GAPDH作为内部控制。

**图7。**
TSA覆盖v-myb分化阻滞并激活组蛋白乙酰化和髓样分化基因。(A类)如图所示，AMV转化的成髓细胞在不使用或使用TSA（+/-TSA）的情况下进行治疗。用Northern印迹分析多聚腺苷酸RNA，用SDS-PAGE和Western印迹分析细胞蛋白。(B)AMV转化的成髓细胞的显微照片。AMV-成髓细胞以悬浮细胞（-TSA）的形式生长，当用TSA（+TSA）处理48小时后，获得粘附的巨噬细胞表型。

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