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.2005年9月15日；65(18):8286-97.
doi:10.1158/0008-5472.CAN-04-1913。

肿瘤坏死因子相关凋亡诱导配体改变线粒体膜脂质

费里·桑德拉 1, 毛罗·德格利·埃斯波斯蒂, 肯尼斯·恩德贝莱, 菲利蒙·戈纳, 大卫·奈特, 马格努斯·罗森奎斯特, 罗亚·科斯拉维·法尔
附属公司

肿瘤坏死因子相关凋亡诱导配体改变线粒体膜脂质

费里·桑德拉等。 癌症研究. .

摘要

肿瘤坏死因子相关凋亡诱导配体（TRAIL）已被证明具有选择性抗肿瘤活性。TRAIL诱导普遍存在的细胞死亡途径，其中caspase激活直接或通过线粒体释放凋亡因子介导；然而，线粒体信号通路的精确组成部分尚未明确界定。值得注意的是，线粒体是克服多种肿瘤对TRAIL耐药性的重要靶点。Bid被认为是死亡受体介导的凋亡过程中参与线粒体的基础，但这种作用依赖于线粒体脂质。在这里，我们报道了TRAIL信号诱导线粒体膜脂，特别是心磷脂的改变。这与半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶的激活无关，并启动线粒体膜对Bid的促凋亡作用。我们揭示了TRAIL信号与膜脂稳态改变之间的联系，膜脂稳态的改变与顶端caspase激活平行发生，但由于caspase-8的同时激活，不会接管细胞死亡模式。特别是，TRAIL诱导的线粒体脂质改变伴随着磷脂酰胆碱细胞内稳态的失衡，导致二酰甘油（DAG）升高。DAG升高反过来激活磷脂依赖性丝氨酸/苏氨酸蛋白激酶C的δ亚型，从而加速半胱氨酸蛋白酶-8的裂解。我们还表明，通过抑制脂质降解酶来保持磷脂酰胆碱体内平衡几乎完全阻碍了前caspase-9的激活，而几乎没有改变caspase-8的激活。

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数字

图1
图1
TRAIL诱导线粒体心磷脂的变化。A、，TRAIL诱导的细胞凋亡：用不同浓度的TRAIL处理HeLa和Jurkat细胞24小时。收集细胞，通过流式细胞术测定亚G细胞的凋亡程度1人口。列，三次独立测定的平均值；酒吧，SD.*，P（P）<0.05，与对照未处理细胞相比，双侧Wilcoxon试验具有统计学意义。B、，TRAIL诱导的心磷脂变化：将Jurkat细胞与TRAIL（10 ng/mL）孵育1小时，然后用NAO染色，用流式细胞仪分析其荧光。C、，线粒体脂质提取物的电喷雾质谱图谱：未经处理(顶部)和TRAIL处理的Jurkat细胞（10 ng/mL，1小时；底部). 尽管TRAIL处理的样品中主要磷脂酰胆碱种类的参考强度相对高于对照样品，但心磷脂区域的MS谱记录为等效的信噪比，以强调心磷脂种类的定量和定性变化。D、，以磷脂酰胆碱为主的线粒体磷脂的电喷雾质谱(个人计算机)物种：光谱被归一化为主要棕榈酰、花生四烯酸-磷脂酰胆碱在782的强度米/z尽管这种脂质与其他含花生四烯酸的物种相比显示出TRAIL诱导的增加（例如，808米/z)和内部参考，如主要磷脂酰乙醇胺(体育课)768个物种米/z注意，在760℃时，TRAIL诱导线粒体棕榈酰、油酰基磷脂酰胆碱严重耗竭米/z(粗箭头).
图2
图2
磷脂酶活性介导TRAIL诱导的细胞凋亡。一个磷脂酶活性的抑制抑制TRAIL诱导的凋亡：HeLa和Jurkat细胞与不同浓度的D609预孵育30分钟，然后添加10 ng/mL TRAIL 24小时，并在碘化丙啶染色后通过流式细胞术评估凋亡。柱，三次独立测定的平均值；酒吧，SD.*，P（P）<0.05，与对照细胞（0μmol/L D609和10 ng/mL TRAIL）相比，双侧Wilcoxon试验具有统计学意义。B类，D609在50μmol/L浓度下无细胞毒性：Jurkat和HeLa细胞被磷脂酶活性的药物抑制剂D609处理24小时，如(一个). 未经处理的细胞与用10或50μmol/L D609处理的细胞之间没有显著差异(P（P）= 0.144). C、 D609不促进短期抗氧化活性：用50μmol/L D609预处理Jurkat细胞1小时。用流式细胞术测定一氯二烷对谷胱甘肽的消耗，评价D609的抗氧化作用。所有测量均一式三份。*，P（P）<0.05，与对照细胞相比，双侧Wilcoxon试验具有统计学意义。D类磷脂酶活性抑制抑制TRAIL诱导的NAO染色变化：用50μmol/L D609预培养Jurkat细胞30分钟，然后用TRAIL（10 ng/mL）培养1小时。E类定量测量用TRAIL、TRAIL和z-VAD以及TRAIL和D609处理的Jurkat细胞中NAO荧光的百分比变化。柱，三个独立实验的平均值，每个实验重复进行；酒吧，SD。
图3
图3
TRAIL诱导的NAO染色变化不依赖于caspase激活。一个，z-VAD不抑制TRAIL诱导的NAO染色变化：Jurkat细胞的NAO荧光的流式细胞术，其与100μmol/L z-VAD-FMK预孵育30分钟，然后TRAIL（10ng/mL）处理1小时，如图所示。1。仅在z-VAD存在下获得的数据与对照样品的数据重叠（未显示数据）。B类，在与（A）相同的条件下，TRAIL治疗1小时后，前caspase-8未被显著处理。
图4
图4
磷脂酶活性对TRAIL的反应增强。一个TRAIL诱导磷脂酶活化：HeLa和Jurkat细胞暴露于TRAIL（10 ng/mL）达指定时间，并使用Amplex红色荧光（a.u.）测定磷脂酶活性。点数三个独立实验的平均值；巴，标准**，0.05<P（P）<0.10，双侧Wilcoxon检验，将0小时与1、3、6和12小时进行比较，具有统计学意义。B类，TRAIL诱导的磷脂酶活性被D609抑制：HeLa和Jurkat细胞与不同浓度的D609预孵育30分钟，然后进行TRAIL处理，如(一个).点数，三个独立实验的平均值，每个实验重复进行一次；巴，标准**，0.05<P（P）<0.10，与对照细胞相比，双侧Wilcoxon试验具有统计学意义（无D609治疗）。C类，TRAIL诱导磷脂酶活性(一个)未被z-VAD抑制：HeLa和Jurkat细胞用100μmol/L泛酶抑制剂z-VAD预培养30分钟，然后用TRAIL（10 ng/mL）处理1、3和6小时。在(一个).
图5
图5
磷脂酶活性介导TRAIL诱导凋亡的线粒体途径。一个，TRAIL以时间依赖的方式诱导caspase-8处理：HeLa细胞接受TRAIL（10 ng/mL）处理指定时间，并对其裂解物进行免疫印迹，以检测caspase-8（p20抗体，Santa Cruz Biotechnology）和肌动蛋白，作为负荷对照。底部，对三个独立实验的p20波段数据进行密度分析。B类和C类磷脂酶活性不会阻止Bid和caspase-8的处理，但会影响细胞色素c（c）释放和caspase-9处理：首先将HeLa细胞与增加浓度的D609孵育30分钟，然后用TRAIL（10 ng/mL）处理6小时。对全细胞裂解物进行caspase-8、Bid、caspase-9和caspase-3的免疫印迹，而对细胞溶质部分进行细胞色素印迹C类; 用肌动蛋白re-blots评估蛋白质负荷(底部). p10和细胞色素条带的密度分析C类使用三个独立实验的数据完成(C、 底部). **, 0.05 <P（P）<0.10，与单独TRAIL治疗相比，双侧Wilcoxon试验具有统计学意义。D类在抑制TRAIL诱导的caspase-8过程中，z-VAD比D609更有效：如图所示，用100μmol/L z-VAD或50 Amol/L D609预培养HeLa细胞的裂解液30分钟，然后用TRAIL（10 ng/mL）处理。使用来自三个独立实验的数据对p20谱带进行了密度分析(底部). **, 0.05 <P（P）<0.10，与单独TRAIL治疗相比，双侧Wilcoxon试验具有统计学意义。
图6
图6
TRAIL诱导依赖磷脂酶活性的DAG快速生成。HeLa和Jurkat细胞未经处理（0μmol/L；一个和B类)或与不同浓度的D609（B）预孵育。然后对细胞进行TRAIL（10 ng/mL）处理3小时，并按照材料和方法中的描述测量DAG含量。柱，三个独立实验的平均DAG水平，每个实验重复进行；酒吧，SD.*，P（P）<0.05，与对照细胞相比，双侧Wilcoxon试验具有统计学意义；**，0.05 <P（P）HeLa和Jurkat细胞的双侧Wilcoxon试验与对照未处理细胞相比<0.10，具有统计学意义。
图7
图7
TRAIL诱导依赖磷脂酶活性的PKCδ磷酸化和线粒体移位。HeLa细胞未经处理或用D609和R59949（50μmol/L）预培养30分钟，然后用TRAIL（10 ng/mL）处理指定时间(一个和B类)或持续6小时(C类). 全细胞裂解物(一个)线粒体组分（B和C）通过免疫印迹分析，使用磷酸化PKCδ、整个PKCδ，肌动蛋白和HSP60的特异性抗体。磷酸化PKCδ（Ser643)，磷-PKCδ（Thr505)和PKCδ使用密度计使用三个独立实验的数据进行分析(底部). **, 0.05 <P（P）<0.10，与未处理样本相比，双侧Wilcoxon检验具有统计学意义。
图8
图8
TRAIL诱导的PKCδ激活介导细胞凋亡，并与DISC诱导的caspase-8激活协同作用。野生型异位表达的HeLa细胞(重量)和主导负向(DN（公称直径）)产生了PKCδ[PKCδ（K376A）]突变体。如图所示，用TRAIL处理这些细胞（1和10 ng/mL）。A、 PKCδ（K376A）抑制和野生型PKCδ增强了蛋白酶-8的加工。B类表达PKCδ的HeLa细胞对TRAIL诱导的细胞凋亡更敏感，并且用D609预处理这些细胞消除了对TRAIL增加的敏感性。*，P（P）<0.05，与对照细胞相比，双侧Wilcoxon试验具有统计学意义（无TRAIL治疗）。C类，DAG激酶抑制剂R59949在异位表达PKCδ的HeLa细胞（野生型）中抑制TRAIL诱导的胱天蛋白酶-8的激活。图5分析了p20带的强度（统计结果如底部).
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