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。2005年9月21日；24(18):3202-13.
doi:10.1038/sj.emboj.7600788。 Epub 2005年8月18日。

长氨基末端结构域通过ER膜的信号锚定序列移位

小田裕一郎 1, 三原胜代, 坂口正雄
附属公司

长氨基末端结构域通过ER膜的信号锚定序列移位

小田裕一郎等。 欧洲工商管理硕士J。 。

摘要

I型信号锚定序列介导N末端结构域（N结构域）跨内质网（ER）膜的移位。为了详细检查易位情况，将二氢叶酸还原酶（DHFR）作为一个长的N结构域融合到突触球蛋白II的N末端。DHFR配体甲氨蝶呤阻止了转运，稳定了DHFR结构域的折叠，并在甲氨喋呤耗尽后恢复。核糖体上升链复合物靶向内质网需要GTP，而N域易位不需要任何核苷酸三磷酸。即使在没有管腔hsp70（BiP）的情况下也观察到明显的移位。当膜靶向作用后，新生多肽从核糖体中释放出来时，N域易位受到抑制，新生链从易位子中释放出来。核糖体在维持易位中间状态中起着关键作用。当DHFR结构域从信号锚定序列中分离出来时，它的易位受到了极大的损害。DHFR结构域的展开和易位必须由信号锚定序列进入易位子的行程驱动。

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数字

图1
图1
N末端DHFR结构域跨内质网膜的转运。(A类)小鼠SytII由一个60残基的N末端亲水结构域、一个27残基的H区域（polka-dotted box）和一个335残基的细胞质结构域组成。DHFR与SytII（D-S）融合。糖化位点存在于SytII的DHFR结构域和N末端区域（开环）。翻译截短的mRNA使RNC达到Arg200（D-S200）。图中的数字表示SytII的残留量或指定区域内的残留量。(B类)在无细胞系统中，在RM缺失（−）或存在（+）的情况下翻译构建物。在D-S200-ter中，Arg后产生了一个终止密码子200箭头、单开圆和双开圆分别表示非糖基化形式、单糖基化形式和二糖基化形式。(C类)mRNA在Arg处截断200转化1小时，并在CHX存在下进一步培养1小时（CHX追逐+车道）。反应后，用EndoH（+车道）处理小份样品。
图2
图2
DHFR域的转位被MTX阻止。(A类)检测野生型和突变型DHFR（Dmut）的易位。Dmut具有三个点突变（C7S、S42C和N49C）。Arg处截短的mRNA200在MTX不存在（−）或存在（+）的情况下转化，并在CHX存在的情况下进一步培养。(B类)在MTX指示浓度的情况下进行翻译，并量化糖基化效率。(C类)全长融合蛋白（D-S和Dmut-S）在COS-7细胞中表达。蛋白质被脉冲标记并用抗SytII抗体免疫沉淀。免疫沉淀剂的等分样品用EndoH处理。(D类)D-S200及其突变体的膜拓扑结构。DHFR结构域可以在不存在MTX的情况下转运到ER腔中并糖基化（开环），但在存在MTX的情况下不能（M）。Dmut结构域甚至在存在MTX的情况下也会发生易位。
图3
图3
移除MTX后，阻止的易位恢复。(A类)在RM和MTX存在下翻译截短的mRNA（D-S200）。在4°C下通过蔗糖垫沉淀膜泡，并用含有1 mM CHX的PSB重新悬浮。(B类)在25°C下培养膜囊泡以恢复N结构域移位。在每个指定的时间，将小份（10μl）直接进行SDS–PAGE（ProK–lanes）。在冰上用ProK处理一小份（ProK+车道）30分钟。星号和双星号分别表示受膜保护的ProK抗性片段和DHFR结构域的ProK耐药核心。(C类)对面板B中显示的结果进行了量化。开圆和正方形分别表示膜保护形式的糖基化（%）和强度。(D类)在膜分离过程中，以指示的KOAc浓度提取膜泡。将再悬浮膜颗粒（P）在25°C下培养1小时（管+车道）。通过SDS-PAGE直接分析沉淀物（追逐车道）和上清液组分（S）的其他等分。
图4
图4
DHFR结构域的易位不需要NTP。(A类)NTPs对靶向性和易位性的影响。在不存在RM的情况下翻译D-S200后，使用脱盐旋转柱将翻译混合物中的小分子耗尽。用RM补充洗脱液。将等分样品直接进行SDS–PAGE（第1列），并在25°C下用指示浓度的NTP培养其他等分样品3小时。对糖基化效率进行了量化。(B类)靶向步骤后对NTPs的DHFR结构域易位的要求。在RM和MTX存在的情况下进行翻译，并使用脱盐柱。洗脱液在指示的NTP存在下培养。
图5
图5
N末端DHFR结构域的易位不需要内腔中的BiP。(A类)碱性萃取膜的蛋白质印迹分析。RM在有（+）或无（−）2 mM AMPPNP的情况下在25°C下培养20分钟，然后用指示pH值的碱性缓冲液提取。提取的膜（通道7-12）、输入RM（通道1）和连续稀释的RM作为参照物（通道2-6）进行SDS-PAGE和免疫印迹分析，使用抗BiP，抗KDEL序列和抗Sec61α抗体。(B类)D-S200 mRNA在已在指定条件下处理的RM存在下翻译1 h，然后在CHX存在下进一步培养1 h。如有说明，在MTX（MTX+通道）存在的情况下进行平移和随后的孵化。
图6
图6
即使在靶向作用后，嘌呤霉素也能抑制DHFR结构域的转移。(A类)如图3B所示获得RM囊泡。在CHX或嘌呤霉素（Puro）存在下观察到易位达指定时间。(B类)结果进行了量化。
图7
图7
易位中间物与易位子的接近程度。(A类)对于特定位置的化学交联，使用Cys缺失的D-S200突变体（D-S200Δ7C）将指定位置的两个或三个疏水残基替换为Cys（粗体字符），其中七个半胱氨酸变为丙氨酸（粗体-斜体字符）。低于残留物的数字对应于原始SytII的残留物数字。(B类)在RM和MTX存在下合成Cys突变体，然后使用同功能交联剂BMH（BMH+通道）进行交联。与Sec61α亚基交联的蛋白质被免疫沉淀。箭头和箭头分别表示与Sec61α和自由探针交联的产物。(C类)翻译Cys突变体（位置2和8），并在25°C下在CHX或嘌呤霉素（Puro）存在下进一步培养。然后进行交联和免疫沉淀。(D类)只要核糖体与新生多肽链结合，新生链就位于转座子附近。它以高抗盐状态与膜结合，但部分对碱敏感。与之前的亲水区域相比，H区域更容易从转座子中释放出来。
图8
图8
DHFR结构域的展开与H区的插入相耦合。(A类)通过从H区插入X残基（X）来分离DHFR结构域，DHFR的C末端区域被40（Δ40）或60（Δ60）残基缩短。DHFR结构域中的糖基化位点和下面的SytII序列分别被称为a位点和b位点。(B类)构建物在RM存在下翻译1小时，然后在CHX存在下进一步培养1小时。对于MTX+通道，在整个培养过程中添加MTX。未糖基化、二糖基化和单糖基化形式分别用向上、向下和开放箭头表示。(C类)分别使用缺乏b位点和a位点的不同结构体来评估a位点或b位点在与面板b相同条件下的糖基化效率。(D类)DHFR结构域部分缺失对易位效率的影响。所示结构在RM存在下翻译，并在CHX存在下进一步培养。显示了a位点的糖基化效率（%）。(E类)N末端DHFR结构域易位的工作模型。核糖体上的新生链通过SRP靶向内质网。DHFR域已折叠，可以绑定MTX。RNC转移到转座子后，H区进入转座子。H区TM螺旋的形成触发DHFR结构域的去折叠和移位。嘌呤霉素从核糖体中释放新生链会影响易位。当DHFR结构域与H区分离超过30个残基时，H区进入易位子的行程不再与DHFR结构区的去折叠相耦合，也不能诱导DHFR结构段的易位。
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