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比较研究
.2005年8月17日；25(33):7601-14.
doi:10.1523/JNEUROSCI.1776-05.2005。

哺乳动物神经营养素突触分泌的差异性囊泡靶向性和时间进程

塔妮娅·布里格德斯基 1, 马蒂亚斯·哈特曼, 沃尔克马尔·莱斯曼
附属公司
比较研究

哺乳动物神经营养因子的不同囊泡靶向和突触分泌的时间过程

塔妮娅·布里格德斯基等。 神经科学. .

摘要

神经营养素是一个分泌型神经元存活和可塑性因子家族，包括NGF、BDNF、神经营养素-3（NT-3）和NT-4。虽然已经描述了BDNF的突触分泌，但细胞内靶向的途径以及神经元中NGF、NT-3和NT-4的分泌尚不清楚。为了直接比较细胞内靶向性和释放特性，所有四种哺乳动物神经营养素在培养的大鼠海马神经元中均表达为绿色荧光蛋白融合蛋白。我们发现，BDNF和NT-3比NGF（46%）和NT-4（23%）更有效地靶向调节分泌途径的树突分泌颗粒（BDNF，在98%的细胞中；NT-3，85%）。对于所有神经干细胞，其余细胞均以构成性分泌途径为靶点。将BDNF前体序列与NT-4融合，可以更有效地将NT-4导向调节分泌途径。所有神经营养素一旦被导向调节分泌途径，就会在突触素I阳性突触前终末附近检测到，并与PSD-95-DsRed（突触后密度-95-Disosoma red）共定位，表明神经营养素的突触后靶向谷氨酸能突触。与用FM4-64[N-（3-三乙基氨丙基）-4-（6-（4-二乙氨基）苯基）六三烯基）吡啶二溴]去染色监测的递质释放动力学相比，去极化诱导突触分泌颗粒释放所有神经营养素的速度较慢（起效延迟，10-30 s；tau=120-307 s）。在神经营养素中，NT-4分泌最快，但仍比递质分泌慢10倍。用莫能菌素预培养神经元（中和粒内pH值，从而溶解肽核）可将BDNF、NGF和NT-3的分泌速度提高到NT-4的值。这些数据表明，分泌颗粒中肽核的溶解是所有哺乳动物神经营养素突触分泌速度的关键决定因素，释放速度与神经营养素的快速传递类作用不相容。

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数字

图1。
图1。
GFP标记神经营养素的完整加工和生物功能。GFP标记的NT在COS7细胞中表达，并在转染后2天分析细胞裂解物和上清液。A类，抗-GFP蛋白质印迹揭示了NT前体在细胞裂解物中的主要存在（顶部，箭头，具有比其他NT更低MW的NT-4前体）和COS细胞上清液中正确处理的成熟NT的主要存在（底部，箭头）。左侧的水平标记表示GFP的位置。B类NT-分别通过过度表达的TrkB和内源性表达的TrkA受体诱导PC12细胞的纤维生长。用TrkB和GFP质粒在1 DIV条件下共同转染PC12细胞，并用分别过度表达GFP标记的BDNF、NGF、NT-3、NT-4或wt-GFP的COS细胞上清液培养3 d，或用rhBDNF培养。C类，与COS细胞上清液和重组（rec.）神经营养素孵育3d后，定量NT-诱导的PC12细胞纤维生长。**与所有NT有显著不同第页< 0.01.D类分别表达wt BDNF和BDNF-GFP的COS细胞和人重组BDNF的抗-BDNF Western blot。印迹表明，用于E类.E类、上清液PC12细胞纤维生长测定和重组BDNF分析D类.*与EGFP显著不同第页< 0.01. 中的数据C类和E类每个实验中来自100个以上的细胞，每个条件下来自两个以上的独立制剂。误差条代表SE。
图2。
图2。
海马神经元中神经营养素的差异性囊泡靶向性。A类，在8DIV处用GFP标记的神经营养因子转染海马神经元，转染后2d进行分析。虽然BDNF和NT-3主要存在于体细胞和远端树突的小泡中（即远端小泡靶向），但NGF和NT-4通常保留在体细胞的小泡结构中，并在树突中显示微弱的GFP信号（即近端靶向）。这是一种细胞特有的现象。B类，量化远端树突中囊泡靶向转染海马神经元的百分比。*与BDNF-GFP和NT-3-GFP显著不同第页< 0.001. 靶向来自n个对每种构建物分析≥8种独立制剂。C类，BDNF-GFP和NT-4-GFP与DsRed共转染用于树突状靶向定量。左柱，典型的BDNF-GFP表达细胞，显示远端囊泡表达。右栏，显示近端靶向的典型NT-4-GFP表达子。合并的图片显示了被GFP标记的NT覆盖的各个树突的百分比（即BDNF细胞为12%，NT-4细胞为4%；参见材料和方法）。D类，GFP标记的BDNF和NT-4的DsRed在树突中共定位的定量。步骤（如中所述C类)显示出显著不同(第页< 10-6)两个NT的远端囊泡和近端表达者的树突状定位值。误差条代表SE。
图3。
图3。
用ER标记物calnexin对神经营养素进行克隆化。将GFP标记的NT在8DIV处转染海马神经元，并用针对10DIV处一般ER标记物calnexin的抗体进行免疫染色A-F公司图中显示了同一视野下GFP荧光信号的共焦图像（左）、红色荧光calnexin染色（中）以及两个荧光通道的合并图像（右）。A类，表达BDNF-GFP的远端囊泡表达器的典型结果。B类，装箱区域A类放大倍率更高。C类,D类，NT-4-GFP表达，显示远端囊泡定位（23%的细胞）。E类,F类表达NT-4-GFP的神经元具有近端定位模式（77%的细胞）。注意，远端囊泡表达子显示树突中NTs与ER标记物的共定位有限(A-D公司)而近端表达者树突中的NT信号积聚在树突内质网中(E类,F类).
图4。
图4。
高尔基体标记物GM130对神经营养素的克隆化。海马神经元如图3所示，在10 DIV用针对高尔基体标记物GM130的抗体进行免疫染色。A-G公司显示GFP（绿色）和GM130（红色）荧光的共焦图像。A类,B类，BDNF-GFP表达细胞显示远端囊泡表达（98%的BDNF细胞）。C类,D类，NT-4表达神经元显示远端囊泡定位（23%的NT-4细胞）。E类高倍镜下，远端囊泡表达者（46%的NGF细胞）中的NGF-GFP。F类,G公司，NT-4表达神经元显示近端定位，周围有微弱的NT信号。注意，远端和近端表达子在体细胞中与高尔基体标记有明显的共定位。
图5。
图5。
神经营养素与分泌粒蛋白II的配体化。在8DIV处转染海马神经元和相应的NT，并在2天后用针对SgII的抗体进行免疫染色。在A-I公司图中显示了相同视野下GFP荧光信号的共焦图像（左）、红色荧光SgII（中）以及两个荧光通道的合并图像（右）。A-D公司，近端表达子的典型示例（此处为NT3-GFP和NT-4-GFP）。白色方框A类和C类以更高的放大倍数显示B类和D类注意树突中NT信号与分泌颗粒标记物没有共定位，尽管这些神经元在树突中明显具有分泌颗粒。E-I公司，远端表达者中树突状SgII信号的NTs染色。E类，低倍镜下BDNF-GFP表达神经元。装箱区域如所示F类放大倍率更高。G-I公司，高倍下其他NT的SgII共定位示例。注意远端表达者中所有NT的树突NT信号与分泌颗粒标记物的显著共定位。
图6。
图6。
BDNF的前原结构域将NT-4导向分泌颗粒。在8DIV处用GFP标记的NT或NT结构域转染海马神经元，转染后2d进行分析。A类将BDNF的前原结构域融合到NT-4的成熟部分，改变了NT-4的定位模式，产生更多具有远端囊泡靶向性的神经元。B类，所示蛋白质靶向的量化。ppB-GFP，用GFP标记的BDNF的分离前原结构域。*与NT-4-GFP显著不同第页< 0.05. 靶向来自n个对每种构建物分析≥3种独立制剂。误差条代表SE。
图7。
图7。
GFP标记的NT和PSD-95-DsRed在同一细胞中共表达后的染色。将海马神经元与相应的GFP标记的NT和PSD-95-DsRd（DNA比例，1:1）以8DIV共转染，并在转染后2天分析细胞。仅显示具有远端囊泡靶向性的细胞。在A-E公司图中显示了相同视野下GFP荧光信号的共焦图像（左）、红色荧光PSD-95（中）和两个荧光通道的合并图像（右）。A类，低倍镜下BDNF-GFP表达神经元。白色框如所示B类放大倍率更高。C-E公司，高倍下其他NT的PSD-95共定位示例。注意NT囊泡簇与PSD-95-DsRed的共定位，表明所有NT都靶向远端囊泡表达者谷氨酸能突触的突触后结构。
图8。
图8。
GFP标记的NT囊泡簇和突触前标记物突触蛋白酶I的相邻定位。用各自的NT以8DIV转染海马神经元，并在2天后用针对突触前标记物蛋白SynI的抗体固定和免疫染色。仅显示具有远端囊泡靶向性的细胞。在A-E公司图中显示了相同视野下GFP荧光信号的共焦图像（左）、红色荧光SynI（中）和两个荧光通道的合并图像（右）。A类低倍镜下NT-4-GFP表达神经元。白色框如所示B类放大倍率更高。C-E公司，高倍镜下其他NT的SynI染色示例。注意树突状NT小泡簇和突触前标记的明显邻近定位，表明所有NT的突触后定位。
图9。
图9。
所有四种哺乳动物NT的突触分泌。海马神经元在8 DIV时与相应的GFP标记的NT和PSD-95-DsRed共同转染(A至C)或DsRed-VAMP(D类). 在10 DIV时，选择与共表达突触标记共定位的树突状NT囊泡簇，进行去极化诱导（50 m）的延时视频记录米K（K）+，5分钟）NT分泌。在A-D公司，左边的图片显示了突触标记物（红色）和相应的GFP标记的NT（绿色）的共定位（黄色）。黑白系列图片显示了延时记录过程中指定时间点的GFP信号。用紫色标记的区域表示所分析的突触NT簇。右侧的图表显示了对左侧所示相同细胞随时间变化的平均GFP荧光强度的分析。箭头表示50米的起点米K（K）+-诱导去极化。虚线水平线将控制期间的荧光变化外推到以后的时间点（见材料和方法）。误差条指示平均值超过的SEn个每个细胞≥3个区域。注意所有四种哺乳动物神经管的突触分泌。初始荧光增加D类表明GFP荧光不受小泡中pH值增加的影响，在表达BDNF-GFP或NT-3-GFP的细胞中经常观察到（见结果）。刺激。，刺激。
图10。
图10。
近端表达子显示结构性分泌。转基因海马神经元如图9所示。A类，NGF-GFP近端表达器、NT-3-GFP远端表达器和GFP对照的GFP荧光。分析标记区域在与对照溶液（0 m）混合时荧光强度的变化米钙2+, 1 μ米TTX）。B类，两个NT表达细胞分泌NT的时间进程A类在10分钟的对照灌注期间（-600至0秒），随后用50米去极化米K（K）+存在2 m米细胞外钙2+（无TTX）。请注意，近端表达物（NGF-GFP；红色括号）中细胞内NT荧光明显丢失，并且该神经元中缺乏调节分泌。相反，远端表达子（NT-3-GFP；绿色括号）显示无可比较的组成性分泌，但NT.rel.，Relative的调节性释放。C类中确定的本构释放量化B类用于近端(n个=15个细胞）和远端(n个=6）表达者。近端表达子显示出比远端表达子更多的组成性分泌(*第页< 0.02). 误差条代表SE。
图11。
图11。
NT分泌对K反应的不同时间进程+-诱导去极化。A-D公司，平均去极化诱导（50 m米K（K）+)显示的NT（NT-4，6个细胞；NGF，4个细胞；NT-3，8个细胞；BDNF，5个细胞）的荧光减弱。误差条代表SE。垂直线表示去极化的开始。每个图中的顶曲线表示阴性对照的平均荧光强度(n个=3个单元格；无K的BDNF-GFP和NT-3-GFP表达子+-诱导去极化）。星号C类和D类表示GFP不抑制引起的荧光增强。E类，平均(n个=3个单元格；>每分析一个电池50个端子）去极化诱导的时间过程（50 m米K（K）+)释放FM4-64染色的突触前终末。与中相同的刺激条件A-D公司。顶部曲线表示未模拟的阴性对照。F类，GFP标记的NT和FM4-64的归一化荧光降低。平均值超过n个每种情况下≥3个细胞。只选择没有初始GFP抑制的细胞。注意半最大分泌的不同时间点（灰色圆圈），代表化合物释放的初始速度。相对，相对；刺激。，刺激。
图12。
图12。
去极化前莫能菌素中和分泌颗粒中的pH值可加快BDNF的释放。在8DIV处用GFP标记的NT转染海马神经元，转染后2d用于分泌A类，BDNF-GFP表达神经元。B类，中标记框的时间序列A类放大倍率更高。C类，中标记区域的荧光强度分析B类注意，使用莫能菌素（4μ米)中和先前酸性颗粒中的pH值。字母a-e表示中所示的图片B类注意BDNF分泌的时间进程更快（与图11相比），在K+-诱导去极化。相对，相对；刺激。，刺激。误差条代表SE。
图13。
图13。
用莫能菌素中和粒内pH值后NT分泌的平均时间进程。A-D公司，表达不同GFP标记NT的海马神经元如图9所示进行处理。莫能新（4μ米)-在随后的去极化过程中，观察到所有NT的诱导荧光增强和释放时间进程的加速（对比图11）。τ值表示单指数拟合曲线的结果n个每个NT≥4个单元。E类，归一化平均去极化诱导（50 m米K（K）+)与莫能菌素预孵育后，显示的神经干细胞的荧光降低，而FM4-64对突触小泡的去染色则分别降低。垂直线表示去极化开始。平均值超过n个每种情况下≥4个细胞。F类，中的装箱区域E类在扩展的时间范围内。请注意，在这些条件下，所有NT的半衰变时间（灰色圆圈）相似，但FM4-64从突触小泡释放的速度仍明显加快。刺激。，刺激。误差条代表SE。
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