Biochemical and immunogenic characterization of soluble human immunodeficiency virus type 1 envelope glycoprotein trimers expressed by semliki forest virus

doi:10.1128/JVI.79.17.10902-10914.2005

比较研究

.2005年9月；79(17):10902-14.

doi:10.1128/JVI.79.17.10902-10914.2005。

semliki森林病毒表达的可溶性人类免疫缺陷病毒1型包膜糖蛋白三聚体的生化和免疫原性研究

马蒂亚斯·N·E·福赛尔¹, 李玉星, 玛丽亚·桑德巴克, 克莉莎·斯维拉, 彼得·利杰斯特罗姆, 约翰·马斯科拉, 理查德·怀亚特, Gunilla B Karlsson赫德斯坦

附属公司

PMID： 16103142
预防性维修识别码：项目经理1193613
内政部： 10.1128/JVI.79.17.10902-10914.2005

比较研究

semliki森林病毒表达的可溶性人类免疫缺陷病毒1型包膜糖蛋白三聚体的生化和免疫原性研究

马蒂亚斯·N·E·福赛尔等。 J维罗尔. 2005年9月.

.2005年9月；79(17):10902-14.

doi:10.1128/JVI.79.17.10902-10914.2005。

作者

马蒂亚斯·N·E·福赛尔¹, 李玉星, 玛丽亚·桑德巴克, 克莉莎·斯维拉, 彼得·利杰斯特罗姆, 约翰·马斯科拉, 理查德·怀亚特, Gunilla B Karlsson Hedestam公司

附属

¹瑞典斯德哥尔摩卡罗林斯卡研究所微生物和肿瘤生物学中心。

PMID： 16103142
预防性维修识别码：项目经理1193613
内政部： 10.1128/JVI.79.17.10902-10914.2005

摘要

目前缺乏可引起广泛中和抗体反应的包膜糖蛋白免疫原仍是人类免疫缺陷病毒1型（HIV-1）疫苗开发的主要挑战。然而，最近设计和构建的稳定可溶性gp140三聚体表明，通过使用更好地模拟功能性病毒棘突复合体的免疫原，可以实现某些中和宽度。使用基因递送系统来驱动这种免疫原的体内表达以刺激针对HIV-1的中和抗体可以通过维持三聚包膜糖蛋白的四元结构而提供优势。在这里，我们描述了重组Semliki森林病毒（rSFV）表达的可溶性HIV-1包膜糖蛋白三聚体的生化和免疫特性。这里的结果表明，rSFV支持稳定的可溶性gp140三聚体的表达，这些三聚体可被构象敏感抗体识别。此外，我们表明rSFV粒子免疫有效地启动了免疫反应，如用纯化的三聚体gp140蛋白单次增强后测得的那样，导致Th1偏向性抗体反应。这与用纯化的gp140蛋白三聚体重复免疫后获得的Th2-偏向抗体反应不同。尽管存在这种差异，但这两种方案均刺激了具有类似效力的中和抗体反应。这表明rSFV可能是病毒载体原蛋白增强方案的有用成分，该方案旨在刺激细胞介导的免疫反应和中和HIV-1抗体。

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数字

**图1。**
HIV-1包膜糖蛋白的重组载体和表达。（A）显示了表达YU2gp120和YU2gp140（-/GCN4）包膜糖蛋白的rSFV载体的示意图。包膜基因插入SFV非结构蛋白（复制酶）的下游。SFV亚基因启动子的位置用箭头表示。（B）脉冲追踪分析[³⁵S] 感染rSFV-YU2gp120或rSFV-YU2gp140（-/GCN4）颗粒的蛋氨酸标记BHK-21细胞。用SDS-PAGE分离细胞裂解液（左侧）和TCA沉淀上清液（右侧）中不同追踪时间点（0.5、2和6 h）的总标记蛋白，并用放射自显影术观察蛋白。（C）感染rSFV-YU2gp120或rSFV-YU2gp140（-/GCN4）24h的BHK-21细胞上清液用MAb IgGb12和G蛋白Sepharose免疫沉淀，并在含有2%BME的SDS-PAGE样品缓冲液中洗脱，用SDS-PACE和银染法分析蛋白。

**图2。**
rSFV表达的包膜糖蛋白的构象完整性。上清液来自[³⁵S] 用HIV-1感染者（HIVIG）和单克隆抗体IgGb12和2G12的混合血清免疫沉淀感染rSFV-YU2gp120或rSFV-YU2gp140（-/GCN4）的蛋氨酸标记的BHK-21细胞。用SDS-PAGE分析蛋白质。

**图3。**
rSFV表达的包膜糖蛋白的寡聚状态。（A）上清液来自[³⁵S] 将感染rSFV-YU2gp120或rSFV-YU2gp140（-/GCN4）的蛋氨酸标记BHK-21细胞在非还原条件下进行TCA沉淀并用SDS-PAGE（3-8%）进行分析。（B）在蓝色天然凝胶（4-12%）上分析rSFV-YU2gp120或rSFV-YU2gp140（-/GCN4）感染的BHK-21细胞的未标记上清液（10μl），转移到膜上，并进行Western blot分析。（C）通过蓝色天然/蛋白质印迹分析，将rSFV-YU2gp140（-/GCN4）感染BHK-21细胞的上清液（10μl）与纯化的YU2gp140（-/GCN4）蛋白（30 ng）并列分析。

**图4。**
免疫接种时间表。小鼠和兔子实验中使用的免疫方案示意图。（A）用Ribi（P）中10μg纯化的YU2gp140（-/GCN4）蛋白免疫小鼠（每组6只）三次，或用10⁷IU rSFV-YU2gp140（-/GCN4）颗粒（SFV），然后按指定间隔在Ribi中纯化10μg YU2gp140（-/GCN4）蛋白。四只对照小鼠用10⁷rSFV-lacZ（SFVlacZ）和10μgβgal免疫家兔（每组4只）⁷IU rSFV-YU2gp140（-/GCN4）颗粒（SFV），然后按指定间隔在Ribi中纯化25μg或5μg YU2gp140（-/GCN4）蛋白。用5×10免疫2只对照兔⁷rSFV-lacZ（SFVlacZ），然后在Ribi中加入25μg BSA。

**图5：。**
用Ribi蛋白免疫小鼠或用rSFV颗粒免疫小鼠后再接种Ribi蛋白质免疫小鼠血清中的包膜结合抗体⁷IU rSFV-YU2gp140（-/GCN4），然后用Ribi中的10μg蛋白质（2×SFV+P）进行一次增强，或用10μg蛋白进行三次增强⁷IU rSFV-YU2gp140（-/GCN4），然后用10μg Ribi蛋白单次增强（3×SFV+P）。（A）每次免疫后12天，单个小鼠血清中包膜结合抗体的IgG ELISA终点滴度。条形代表组几何平均值；ND表示未确定。（B）在三只单独的小鼠中，分别在蛋白质组（2×P和3×P）和3×SFV+蛋白质组（3×SFV和3×SFV+P）中，在最终蛋白质增强前后滴定包膜结合IgG1抗体（上面板）和IgG2a抗体（下面板）。（C） IgG1:IgG2a比值是通过将每只小鼠（黑条，3×P组；白条，3 x SFV+P组；）在1:6250血清稀释液中的IgG1和IgG2aOD值除以来计算的。

**图6。**
CD4分析⁺用rSFV原蛋白增强或纯蛋白方案免疫的小鼠的T细胞反应。重组YU2gp120用于体外刺激YU2gp140（-/GCN4）免疫小鼠的脾细胞，以测量包膜特异性CD4⁺T细胞反应。细胞因子产生细胞显示为斑点形成单位（SFU）/10⁶细胞。（A） CD4细胞⁺T细胞耗竭控制。CD4的贡献⁺通过比较总应答和CD4应答来评估IFN-γELISPOT试验中的T细胞⁺T细胞缺失的脾细胞培养。显示了用YU2gp120或ConA刺激的代表性小鼠（#1和#2）的数据。（B）用10⁷在用培养基或重组YU2gp120蛋白刺激后，在IFN-γELISPOT测定中评估IU rSFV-YU2gp140（-/GCN4）（2×SFV和3×SFV）。数据以组平均值表示，其中每个小鼠的反应被确定为来自三个重复微孔的平均ELISPOT值。（C）用纯化的Ribi（3×P）YU2gp140（-/GCN4）蛋白免疫三次或用10×P免疫三次的小鼠脾细胞，进行IFN-γ、IL-4和IL-2 ELISPOT分析⁷IU rSFV-YU2gp140（-/GCN4），然后在Ribi中用YU2gp140（-/GCN4）蛋白单次增强（3×SFV+P）。对照小鼠用rSFV-lacZ免疫两次，然后用Ribi中的βgal蛋白进行单次增强（Ctrl）。计算每只小鼠用培养基或YU2gp120刺激的三个重复孔的平均ELISPOT值。数据显示为SFU/10⁶从YU2gp120模拟井中获得的值减去中等模拟井中得到的值后的细胞。ND（未检测到）表示在一组中未检测到阳性反应者。

**图7。**
用Ribi蛋白免疫家兔或用rSFV颗粒免疫家兔，然后再免疫Ribi蛋白质。用25μg纯化的YU2gp140（-/GCN4）蛋白免疫家兔三次，或用5×10⁷IU rSFV-YU2gp140（-/GCN4），然后在Ribi中添加25μg蛋白质（2×SFV+蛋白质；兔子5-8）。每次接种后10天提取的免疫兔血清通过五倍系列稀释液（从1/50稀释液开始）进行包膜结合抗体分析。不同时间点单个兔子的数据如下：出血前、空白方块；第一次注射后，填充方块；第二次注射后，三角形；第三次注射后，打圈。三次免疫后的终点滴度用开放箭头标记。

**图8。**
对免疫家兔血清中的一组HIV-1分离物的体外中和活性。用Ribi中25μg纯化的YU2gp140（-/GCN4）蛋白免疫三次或用5×10免疫两次的兔子1:5稀释血清的中和活性⁷IU rSFV-YU2gp140（-/GCN4），然后在Ribi中添加25μg蛋白质（2×SFV+蛋白质；兔子5-8）。对照动物（兔子9和10）用5×10免疫两次⁷IU rSFV-lacZ，然后是Ribi中的25μg BSA。每个病毒分离物下的数字代表中和的百分比，颜色代码显示不同的中和水平（>80%中和，红色；60-80%中和，黄色；40-59%中和，绿色）。使用免疫前血清建立每只兔子的基线中和活性，并从所示值中减去这些值。中和等于或小于零表示≤0。

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1. Barnett，S.W.，S.Lu，I.Srivastava，S.Cherpelis，A.Gettie，J.Blanchard，S.Wang，I.Mboudjeka，L.Leung，Y.Lian，A.Fong，C.Buckner，A.Ly，S.Hilt，J.Ulmer，C.T.Wild，J.R.Mascola，L.Stamatattos。2001.在第二个高变区部分缺失后，低聚物人类免疫缺陷病毒1型（HIV-1）包膜抗原诱导抗原发性HIV-1分离株的中和抗体的能力得到改善。J.维罗尔。75:5526-5540.-项目管理咨询公司-公共医学
1. Berglund，P.、M.N.Fleeton、C.Smerdou和P.LiljeströM。1999.用重组Semliki Forest病毒免疫小鼠，可预防流感攻击。疫苗17:497-507。-公共医学
1. Berman，P.W.、T.J.Gregory、L.Riddle、G.R.Nakamura、M.A.Champe、J.P.Porter、F.M.Wurm、R.D.Hershberg、E.K.Cobb和J.W.Eichberg，1990年。接种重组糖蛋白gp120而非gp160后保护黑猩猩免受HIV-1感染。自然345:622-625。-公共医学
1. Binley，J.M.、R.W.Sanders、B.Clas、N.Schuelke、A.Master、Y.Guo、F.Kajumo、D.J.Anselma、P.J.Maddon、W.C.Olson和J.P.Moore。由gp120和gp41亚基之间的分子间二硫键稳定的重组人免疫缺陷病毒1型包膜糖蛋白复合物是三聚病毒体相关结构的抗原模拟物。J.维罗尔。74:627-643.-项目管理咨询公司-公共医学
1. Brand，D.、F.Lemiale、G.Thibault、B.Verrier、S.Lebigot、P.Roingeard、L.Buzelay、S.Brunet和F.Barin，2000年。源自T细胞适应型分离株或原代人类免疫缺陷病毒分离株的重组包膜糖蛋白的抗原性及其与免疫原性的关系。病毒学271:350-362。-公共医学

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[1] Barnett，S.W.，S.Lu，I.Srivastava，S.Cherpelis，A.Gettie，J.Blanchard，S.Wang，I.Mboudjeka，L.Leung，Y.Lian，A.Fong，C.Buckner，A.Ly，S.Hilt，J.Ulmer，C.T.Wild，J.R.Mascola，L.Stamatattos。2001.在第二个高变区部分缺失后，低聚物人类免疫缺陷病毒1型（HIV-1）包膜抗原诱导抗原发性HIV-1分离株的中和抗体的能力得到改善。J.维罗尔。75:5526-5540.-项目管理咨询公司-公共医学

[2] Barnett，S.W.，S.Lu，I.Srivastava，S.Cherpelis，A.Gettie，J.Blanchard，S.Wang，I.Mboudjeka，L.Leung，Y.Lian，A.Fong，C.Buckner，A.Ly，S.Hilt，J.Ulmer，C.T.Wild，J.R.Mascola，L.Stamatattos。2001.在第二个高变区部分缺失后，低聚物人类免疫缺陷病毒1型（HIV-1）包膜抗原诱导抗原发性HIV-1分离株的中和抗体的能力得到改善。J.维罗尔。75:5526-5540.-项目管理咨询公司-公共医学

[3] Berglund，P.、M.N.Fleeton、C.Smerdou和P.LiljeströM。1999.用重组Semliki Forest病毒免疫小鼠，可预防流感攻击。疫苗17:497-507。-公共医学

[4] Berglund，P.、M.N.Fleeton、C.Smerdou和P.LiljeströM。1999.用重组Semliki Forest病毒免疫小鼠，可预防流感攻击。疫苗17:497-507。-公共医学

[5] Berman，P.W.、T.J.Gregory、L.Riddle、G.R.Nakamura、M.A.Champe、J.P.Porter、F.M.Wurm、R.D.Hershberg、E.K.Cobb和J.W.Eichberg，1990年。接种重组糖蛋白gp120而非gp160后保护黑猩猩免受HIV-1感染。自然345:622-625。-公共医学

[6] Berman，P.W.、T.J.Gregory、L.Riddle、G.R.Nakamura、M.A.Champe、J.P.Porter、F.M.Wurm、R.D.Hershberg、E.K.Cobb和J.W.Eichberg，1990年。接种重组糖蛋白gp120而非gp160后保护黑猩猩免受HIV-1感染。自然345:622-625。-公共医学

[7] Binley，J.M.、R.W.Sanders、B.Clas、N.Schuelke、A.Master、Y.Guo、F.Kajumo、D.J.Anselma、P.J.Maddon、W.C.Olson和J.P.Moore。由gp120和gp41亚基之间的分子间二硫键稳定的重组人免疫缺陷病毒1型包膜糖蛋白复合物是三聚病毒体相关结构的抗原模拟物。J.维罗尔。74:627-643.-项目管理咨询公司-公共医学

[8] Binley，J.M.、R.W.Sanders、B.Clas、N.Schuelke、A.Master、Y.Guo、F.Kajumo、D.J.Anselma、P.J.Maddon、W.C.Olson和J.P.Moore。由gp120和gp41亚基之间的分子间二硫键稳定的重组人免疫缺陷病毒1型包膜糖蛋白复合物是三聚病毒体相关结构的抗原模拟物。J.维罗尔。74:627-643.-项目管理咨询公司-公共医学

[9] Brand，D.、F.Lemiale、G.Thibault、B.Verrier、S.Lebigot、P.Roingeard、L.Buzelay、S.Brunet和F.Barin，2000年。源自T细胞适应型分离株或原代人类免疫缺陷病毒分离株的重组包膜糖蛋白的抗原性及其与免疫原性的关系。病毒学271:350-362。-公共医学

[10] Brand，D.、F.Lemiale、G.Thibault、B.Verrier、S.Lebigot、P.Roingeard、L.Buzelay、S.Brunet和F.Barin，2000年。源自T细胞适应型分离株或原代人类免疫缺陷病毒分离株的重组包膜糖蛋白的抗原性及其与免疫原性的关系。病毒学271:350-362。-公共医学

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