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.2005年8月；4(8):1420-33.
doi:10.1128/EC.4.8.1420-1433.2005。

小鼠巨噬细胞感染过程中新生隐球菌基因的表达

魏华凡 1, 彼得·克劳斯, 玛丽·乔西·波伊, 约瑟夫·海特曼
附属公司

小鼠巨噬细胞感染过程中新生隐球菌基因的表达

魏华凡等。 真核细胞. 2005年8月.

摘要

真菌病原新生隐球菌在巨噬细胞吞噬下存活并在其内部增殖，最终形成潜伏感染，作为兼性细胞内病原体，可逃避巨噬细胞的控制，导致播散性疾病。这个过程被假设为对新生隐球菌的发病机制很重要；然而，人们对新生隐球菌如何适应和克服巨噬细胞不利的细胞内环境知之甚少。利用DNA微阵列技术，我们研究了新生隐球菌对小鼠巨噬细胞吞噬作用的转录反应。利用定量逆转录-PCR和绿色荧光蛋白报告菌株验证了几个基因的表达谱。己糖、氨基酸和铁的多个膜转运蛋白以及参与氧化应激反应的基因上调。参与自噬、过氧化物酶体功能和脂质代谢的基因也被诱导。有趣的是，几乎整个交配型基因座在内化24小时后表达增加，表明感染与MAT基因座之间存在内在联系。Gpa1-环AMP-蛋白激酶A途径中的基因也上调。发现gpa1和pka1突变体在巨噬细胞感染中受到损害，证实了这种毒力途径的重要作用。大部分被抑制的基因参与核糖体相关功能、rRNA加工和翻译起始/延伸，这意味着翻译减少是吞噬作用的中心反应。总之，该基因表达谱使我们能够解释新生隐球菌对细胞内感染过程的适应，并为寻找编码新毒力属性的基因提供信息。

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数字

图1。
图1。
激活材料吞噬过程中α位点转录。随机基因集和跨基因的对数转换微阵列数据材料这里绘制了α基因座，以及实时RT-PCR分析中所选基因的对数转换数据材料α位点。1和-1处的线表示显著性阈值（增加或减少两倍）。A血清型图材料α位点表示基因在该区域的位置。以未扩增的总RNA为模板，重复进行三次RT-PCR。通过阈值循环法确定每个基因的表达值行动1（编码肌动蛋白）用于使感兴趣基因的表达正常化。对于每个基因，通过比较其在巨噬细胞摄入样品和培养基对照中的标准化表达值来确定其相对诱导。此处显示了六个重复的平均值。
图2。
图2。
吞噬诱导基因的表达和功能分析。A.定量实时RT-PCR分析捷克1,CGL1公司、和清洁石油产品2基因。以未扩增的总RNA为模板，在每个时间点重复进行三次RT-PCR。通过阈值循环法确定每个基因的表达值行动1（编码肌动蛋白）用于使感兴趣基因的表达正常化。对于每个基因，通过比较其在巨噬细胞摄入样品和培养基对照中的正常表达来确定其相对诱导。这里显示了从RT-PCR和微阵列推导出的平均诱导率。B.巨噬细胞中缺失突变体的生长。两个独立突变株的细胞捷克1(捷克共和国-三和捷克共和国-4)或清洁石油产品2(cpp2-11和cpp2-18)和fhb1型突变体及其补体(FHB1型)（21）以2:1的MOI接种到巨噬细胞中，并在培养24小时后重新分离隐球菌细胞。通过电镀再分离的细胞并测定CFU来测量生长。开放柱，巨噬细胞生长；封闭柱，在巨噬细胞培养条件下的培养基中生长。实验重复了三次，误差条代表平均值的标准偏差。
图3。
图3。
的增长C.新生代巨噬细胞中的突变体。隐球菌细胞gpa1标准,pka1型,lac1公司，或fhb1型用MOI为2:1的巨噬细胞接种突变体，并在孵育24小时后重新分离隐球菌细胞。通过电镀再分离细胞和计数CFU来测量生长。A.巨噬细胞的生长。开放柱，初始接种；实心柱，在巨噬细胞中培养24小时后生长。B.在37°C和5%CO的巨噬细胞培养基中单独生长2.
图4。
图4。
的表达式拉丁美洲和加勒比海地区1赞成的意见-GFP公司记者。这个拉丁美洲和加勒比海地区1赞成的意见-绿色荧光粉报告菌株在H99背景下构建，并通过荧光显微镜监测其表达。A.诱导拉丁美洲和加勒比海地区1赞成的意见-GFP公司黑色素诱导条件下的记者。隐球菌H99或拉丁美洲和加勒比海地区1赞成的意见-GFP公司该菌株在30°C、0.1%葡萄糖的天冬酰胺培养基中培养4h，然后进行荧光显微镜检查。上部面板是光学显微镜的图像；下面的面板是荧光图像。B.再加压LAC1型赞成的意见-GFP公司葡萄糖报告。这个LAC1型赞成的意见-GFP公司报告菌株在含有0.1%葡萄糖的天冬酰胺培养基中培养4小时，然后转移到含有2%葡萄糖的YPD中，继续培养2或4小时。上面板，光图像；下部面板，荧光图像。箭头表示缺少GFP的芽。C.表示拉丁美洲和加勒比海地区1赞成的意见-GFP公司巨噬细胞中的报告基因。H99或拉丁美洲和加勒比海地区1赞成的意见-GFP公司在荧光显微镜检查之前，将报告菌株接种到巨噬细胞中并孵育4或16小时。上部面板，轻图像；下部面板，荧光图像。“胞外”表示H99细胞未被巨噬细胞吞噬。
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引用人

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工具书类

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