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.2005年7月；3（7）：e233。
doi:10.1371/journal.pbio.0030233。 Epub 2005年6月21日。

Rab7与早期内体结合，介导Semliki森林病毒的分选和向晚期内体的转运

安德烈亚斯·冯德海特 1, 阿里·海伦纽斯
附属公司

Rab7与早期内体结合，介导Semliki森林病毒向晚期内体的分选和转运

安德烈亚斯·冯德海特等。 公共科学图书馆生物. 2005年7月.

摘要

Semliki森林病毒（SFV）通过网格蛋白介导的内吞作用内化，并通过早期内体运输到晚期内体和溶酶体。在未转染细胞中使用免疫荧光，在转染GFP和RFP标记的Rab5、Rab7、Rab4和Arf1的活细胞中使用视频增强的三色荧光显微镜，跟踪单个荧光标记的SFV颗粒的细胞内途径。这些病毒从Rab5阳性的早期内体发展到包含Rab5和Rab7的早期内体内体（约占总数的10%）。SFV被隔离在Rab7结构域中，当这些结构域分离为不含Rab5、Rab4、EEA1、Arf1和转铁蛋白的单独运输载体时，SFV从早期内体中分离出来。这一过程与Arf1以及早期内体的酸性pH无关。诺卡唑治疗表明，微管有助于运输载体的释放。组成性非活性Rab7T22N的表达导致SFV在早期内体中积聚。我们得出的结论是，Rab7被招募到早期内体中，在那里它形成不同的结构域，介导货物分选以及晚期内体靶向运输囊泡的形成。

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数字

图1
图1。荧光标记SFV糖蛋白E1和E2
（A） 通过非还原性SDS-PAGE分析SFV-FITC，左侧车道考马斯兰染色，右侧车道荧光照相。E1（49 kDa）和E2（52 kDa；衣壳蛋白C和E3不是。（B） Cy5标记SFV的共焦显微镜，显示大小均匀的单个斑点（约0.4μm）。显示了两个点的相对荧光强度分布。荧光的分布符合高斯函数。（拟合使用以下公式计算：年=e（电子） −x个2.）比例尺代表1μm。M（M）
图2
图2。内化、渗透和退化
允许SFV-Cy5（MOI为20）在4°C下与Vero细胞结合60分钟，然后在不同的时间段转移到37°C。（A） 细胞在加热10分钟后固定并渗透，然后使用EEA1抗体进行免疫染色。SFV-Cy5存在于EEA1阳性内体中。（B） 细胞在加热20分钟后固定，并用抗Rab7抗体进行免疫染色。SFV-Cy5存在于Rab7-阳性内体中。（C） 使用未标记的SFV，在加热30分钟后固定并渗透细胞，并用抗LAMP-1和抗E1/E2抗体进行免疫染色。SFV存在于LAMP-1阳性的内体中。（D） 使用基于FACS的感染分析来确定SFV在进入期间的穿透时间。用1的MOI感染Vero细胞。天然气4在不同的时间点添加Cl以抑制感染。细胞在37°C下进一步培养5小时，然后固定并免疫染色以检测新合成的糖蛋白(n个= 3). （E） 用免疫印迹法测定E1/E2降解情况。病毒（MOI为50）在寒冷中与Vero细胞结合，未结合的病毒被冲走。细胞孵育指定时间，并通过蛋白酶K处理去除表面相关病毒。细胞被裂解，SDS-PAGE后，用抗E1/E2抗体进行免疫印迹。注意，与未还原的样品（图1A）相反，E1和E2在还原后在SDS-PAGE中共迁移。比例尺表示5μm。
图3
图3。用两种标记物标记的内切体显示早期内切体中存在Rab7
固定Vero细胞并用共焦显微镜观察。（A） 使用抗EEA1（绿色）和抗Rab7（红色）抗体（B–F）对免疫标记细胞进行共焦显微镜观察。用荧光蛋白标记的构建物转染细胞，如下所示：（B）GFP-Rab5和RFP-Rab7，（C）GFP-Rab4和RFP-Rab5，（D）Arf1-GFP和RFP-Rab5。箭头显示两个标记中的一个标记的单个内体阳性，箭头表示两个标记的内体阳性。比例尺代表10μm。
图4
图4。通过EEA1和Rab7内切体标记SFV的研究进展
（A） Vero细胞的共焦显微镜。允许SFV-Cy5在4℃下与Vero细胞（MOI为20）结合60 min，然后转移到37℃，并在不同时间（a，0 min；b，10 min；C，20 min；d，30 min）后固定，并用EEA1和抗Rab7抗体进行免疫标记。显示了每个时间点的三种病毒。比例尺代表10μm。在a组中，SFV没有与任何内体标记物共存；在b组中，SFV定位于EEA1阳性内体；在图c中，SFV定位于EEA1和Rab7阳性的内体中；在面板d中，SFV定位于Rab7-阳性内体。（B） 随着时间的推移，含有EEA1但不含Rab7（绿线）的内体、同时含有EEA1和Rab7的内体（蓝线）以及只含Rab6（红线）的结构中SFV-Cy5的定量。这些值进行了标准化处理，以使100%表示针对降解进行校正的每个时间点的细胞相关病毒数量。
图5
图5。Rab7和SFV在早期内体中的分类
（A–C）从升温20分钟后开始的时间序列中获得的选定图像。Vero细胞转染（A）GFP-Rab5和RFP-Rab7，（B）GFP-Rab4和RFP-Rab5，或（C）GFP-Rab4和RF P-Rab6；然后添加SFV-Cy5。SFV-Cy5从Rab7-阳性囊泡（箭头）中的Rab5-和Rab4-阳性内体中分离出来。比例尺代表2.5μm。（D） 用共聚焦显微镜观察转染显性阴性GFP-Rab7T22N和RFP-Rab5的Vero细胞，然后用SFV-Cy5培养。病毒在37°C下内化1小时。SFV-Cy5存在于大的Rab5阳性内体（箭头）中。比例尺代表10μm。（E和F）转染显性阴性GFP-Rab7T22N（插图）的Vero细胞的共焦显微镜，然后用SFV-Cy5培养。病毒在37°C下内化1小时。对细胞进行固定、透化，并对（E）EEA1或（F）LAMP-1进行免疫染色。总之，86.3%的SFV-Cy5（红色）存在于大型EEA1阳性内体中（[E]中为绿色），而不存在于LAMP-1阳性结构中（[F]中为绿）（箭头）。注意，SFV-Cy5存在于未转染细胞的LAMP-1阳性结构中（箭头所示）。比例尺代表10μm。
图6
图6。SFV对晚期内切体的分类与Arf1和pH无关
（A和B）取自升温后约20分钟记录的时间序列的选定图像。将（A）Arf1-GFP和RFP-Rab5或（B）Arf1-GFP和RFP-Rab7转染Vero细胞，然后添加SFV-Cy5。Arf1存在于Rab5阳性内体上。SFV-Cy5在Rab7阳性囊泡（箭头）中与Arf1和Rab5阳性内体分离。比例尺代表2.5μm。（C和D）转染GFP-Rab7（[E]中为绿色）或GFP-Rap5（[D]中为绿）和Arf1T31N-myc并与SFV-Cy5（红色）孵育的Vero细胞的共焦显微镜。细胞在内化1小时后固定、渗透并使用抗myc-tag（9E10）抗体进行免疫染色。SFV-Cy5在Rab5中不存在，但在Rab7-阳性内体（箭头）中存在，这表明将SFV分类为Rab7--阳性内体不需要Arf1。比例尺代表10μm。（E） 巴非霉素A的宽场荧光图像1在SFV-AF594内化后2 h，经处理（25 nM）表达YFP-Rab5和CFP-Rab7的Vero细胞。SFV存在于Rab7阳性内体（箭头）中，表明SFV分选为Rab7阴性内体不需要酸性pH值。比例尺代表5μm。（F） NH公司4表达YFP-Rab5和CFP-Rab7的Cl-处理过的（20 mM）Vero细胞与Dextran–Texas Red孵育2 h。Rab7-阳性内体（箭头）中存在Dextran，这表明SFV和Dextan不需要酸性pH值即可分选为Rab7--阳性内体。比例尺代表5μm。
图7
图7。内分体沿微管移动
（A） 用5μM诺卡唑处理后转染GFP-Rab5和RFP-Rab7的Vero细胞的共焦显微镜。内切体扩大，许多（约75%）Rab5阳性的内切体对Rab7（箭头）也呈阳性。比例尺代表10μm。（B） 将如（A）中处理的细胞与SFV-Cy5一起孵育，并在加热后1小时固定。SFV-Cy5存在于Rab5和Rab7阳性的较大内体中（箭头）。比例尺代表5μm。（C） 用5μM诺卡唑处理并用SFV-Cy5孵育的Vero细胞的共焦显微镜。在37°C下内化1小时后，细胞被固定、渗透，并对EEA1和Rab7进行免疫染色。两种标记物的内分泌物均呈阳性（白色矩形）（41%），SFV-Cy5在这些结构中被捕获（黄色矩形）。（A）中所示的Rab5突起在（C）中未见，可能是由Rab蛋白过度表达引起的。比例尺代表10μm。
图8
图8。SFV从质膜到溶酶体的转运途径示意图
在揭开氯氰菊酯包衣后，初级内吞囊泡将病毒传递到Rab5阳性的早期内体，其中包含Rab5和Arf1结构域，但不包含Rab7。然后Rab7被招募到这些内体中，并形成额外的结构域（蓝色），排除其他早期内体相关的小GTPase。病毒进入Rab7结构域，当该结构域以含有Rab7的运输囊泡的形式离开内体时，病毒也会离开Rab5阳性细胞器。含有Rab7的载体沿着微管移动，并与其他载体或晚期内体融合。此外，还显示了从早期内体到晚期内体的另一种途径，涉及Arf1和ECV，SFV不使用它们。CCP，氯氰菊酯涂层坑；CCV，氯氰菊酯包被囊泡；EE，早期内体；MT，微管；RE，回收内体；LE，晚期内体；溶酶体。
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