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.2005年7月；7(7):719-23.
doi:10.1038/ncb1274。 Epub 2005年6月5日。

靶向mRNAs对哺乳动物P体的MicroRNA-dependent定位

刘继东 1, 马尔科·安东尼奥·巴伦西亚·桑切斯, 格雷戈里·汉农, 罗伊·帕克
附属公司

靶向mRNAs对哺乳动物P体的MicroRNA-dependent定位

刘继东等。 Nat细胞生物学. 2005年7月.

摘要

小RNA，包括小干扰RNA（siRNA）和小RNA（miRNAs）可以通过几种不同的效应机制沉默靶基因。尽管人们越来越了解siRNA-directed mRNA切割，但miRNAs抑制蛋白质合成的机制尚不清楚。最近的研究表明存在特定的细胞质病灶，本文称为加工体（P-体），其中含有未翻译的mRNA，可作为mRNA降解的位点。在这里，我们证明Argonaute蛋白——RNA干扰（RNAi）效应器复合体RISC的标志性成分——定位于哺乳动物的P体。此外，靶向内源性或外源性miRNAs翻译抑制的报告mRNAs以miRNA-依赖的方式集中在P小体中。这些结果提供了miRNA功能与哺乳动物P-体之间的联系，并表明RISC的翻译抑制将mRNA传递到P-体，无论是作为抑制蛋白质合成的原因还是结果。

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图1
图1
精氨酸蛋白定位于哺乳动物的P体。(一)Myc-tagged Ago2蛋白在U2-OS细胞中表达。通过FITC-偶联抗Myc染色，Ago2蛋白定位于离散的细胞质病灶。(b条)用兔抗Ago2抗体染色，将内源性Ago2蛋白定位于U2-OS细胞。(c（c）)精氨酸蛋白与GFP或标记的Dcp1a共定位，这是哺乳动物P-体的特征成分。使用罗丹明红结合的抗Myc抗体对精氨酸蛋白进行可视化。Dcp1a通过GFP或FITC缀合的抗-Flag显现。
图2
图2
精氨酸蛋白结合哺乳动物P体的成分。将Myc-tagged Ago1或Ago2与GFP-tagged Dcp1a或Flag-taged Dcp2表达质粒联合转染人293T细胞（如图所示）。(一)如图所示，用抗Myc或抗GFP抗体对Ago1或Ago2（抗Myc）或Dcp1a（抗GFP）免疫沉淀物进行免疫印迹。(b条)Ago1或Ago2（抗Myc）或Dcp2（抗标记）免疫沉淀物用所示的抗Myc或抗标记抗体进行免疫印迹。(c（c）)在Ago2（抗Myc）或Dcp1a（抗GFP）免疫沉淀之前，用RNaseA处理提取物。免疫复合物用所示的抗Myc或抗GFP抗体进行免疫印迹。(d日)在Ago2（抗Myc）或Dcp2（抗Flag）免疫沉淀之前，用RNaseA处理提取物。免疫复合物用所示的抗Myc或抗Flag抗体进行免疫印迹。
图3
图3
精氨酸蛋白在P小体中的积累需要一个完整的siRNA-结合域。(一)野生型和突变型Ago2蛋白Ago2-PAZ9和Ago2-PAZ10（如图所示）在转染荧光素酶siRNA的细胞中以Myc表位融合的形式表达。使用抗Myc抗体的Western blotting检测蛋白表达（上图）。通过免疫复合物中提取的RNA的northern印迹法测量小RNA结合（中间面板）。还针对互补底物（底部面板）测量了核酸酶活性。(b条)通过抗Myc抗体的免疫染色测定野生型和非小RNA结合突变Ago2蛋白的亚细胞定位。(c（c）)Myc标记的野生型或突变型Ago2蛋白与GFP标记的Dcp1a共同表达。如图所示，用抗Myc或抗GFP抗体进行免疫印迹分析Ago2（抗Myc）或Dcp1a（抗GFP）免疫沉淀物。
图4
图4
靶mRNAs对哺乳动物P体的miRNA-依赖性定位。(一)将表达let-7靶点、Myc–Ago2蛋白和MS2–YFP–NLS的质粒共转染到U2-OS细胞中。使用融合蛋白间接观察报告者mRNA。使用罗丹明红结合的抗Myc抗体观察Ago2蛋白。(b条)分析与中的相同一但靶mRNA不含lin-41 3′UTR片段。(c（c）)CXCR4靶标与MS2–YFP–NLS和Myc–Ago2共表达。检测与中相同一. (d日)CXCR4报告基因与MS2–YFP–NLS以及（上部）或（下部）Myc–Ago2在同样转染了CXCR4系列小干扰RNA。用兔抗Ago2抗体观察内源性Ago2。图表表示目标显示在每个面板的旁边。
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中的注释

  • RNAi和P-body连接。
    罗西JJ。 罗西JJ。 自然细胞生物学。2005年7月；7(7):643-4. doi:10.1038/ncb0705-643。 自然细胞生物学。2005 PMID：15990892 没有可用的摘要。

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