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.2005年6月；166(6):1655-69.
doi:10.1016/S0002-9440（10）62476-5。

瘦素和脂联素的作用：脂肪细胞因子调节肝纤维化和星状细胞生物学的新范式

丁小坤 1, Neeraj K Saxena公司, 松柏林, 徐爱民, Shanthi Srinivasan公司, 弗兰克·阿纳尼亚
附属公司

瘦素和脂联素的作用：脂肪细胞因子调节肝纤维化和星状细胞生物学的新范式

丁小坤等。 美国病理学杂志. 2005年6月.

勘误表in

  • 《美国病理学杂志》。2008年12月；173(6):1929. 徐，阿明[改为徐，阿敏]

摘要

虽然瘦素是促进肝纤维化的关键脂肪因子，但脂联素可以预防肝损伤。为了确定这些脂肪因子在肝纤维化中的作用，并了解它们在体内的表达，fa/fa大鼠及其瘦小的室友接受了胆管结扎（BDL）。胶原蛋白和α-平滑肌肌动蛋白（α-SMA）的组织形态计量学显示，瘦鼠（而非fa/fa同窝鼠）具有显著的纤维化，肝星状细胞（HSC）大量活化。瘦-BDL大鼠肝静脉中的瘦素浓度显著高于瘦sham-operated、fa/fa BDL或fa/fa sham-operation大鼠。通过免疫组织化学观察瘦素和α-SMA在活化的HSC中的共同定位。实时逆转录酶-聚合酶链反应和Western blot分析证实，激活的HSC中存在瘦素和α-SMA，而非静止的HSC，而只有静止的HSCs合成脂联素mRNA和蛋白质。活化的HSC中脂联素过度表达降低了增殖，增加了凋亡，并降低了α-SMA和增殖细胞核抗原的表达。在活化和静止的HSC中均检测到脂联素受体（AdipoR1和AdipoR2），但只有活化的HSC在使用球状或全长脂联素治疗后产生显著的凋亡。脂联素可逆转HSC激活，维持HSC静止，或在肝纤维化中具有重要的治疗意义。

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数字

图1
图1
成熟胶原蛋白的Picrosius红色染色显示瘦肉中有显著沉积，但不是fa/fa，大鼠接受BDL。苦味酸红染色显示主要在支撑结构周围发现胶原沉积(A类–C类,黑色箭头).医生：显示胶原蛋白沉积的典型图像(黑色箭头)以及广泛的桥接性纤维化(蓝色箭头)过渡到肝硬化。电子邮箱：直方图，表示扫描的胶原纤维平均百分比/载玻片总面积的图像定量，单位为μm2±根据材料和方法中的描述确定的SEM*P（P）<0.05，比较了贫BDL与非正常运行或fa/faBDL大鼠。原始放大倍数，×10(D类).
图2
图2
低倍和高倍放大免疫组化分析瘦肉和fa/faBDL大鼠。A类和B类：Shamoperated的代表性显微照片fa/fa瘦小的窝友在血管支撑结构附近显示α-SMA染色。C类和电子邮箱：BDL操作的代表性显微照片fa/fa低倍放大的大鼠(C类)和高倍放大(E类)显示与上述两种情况相似的染色模式fa/fa治疗组。D类和传真：BDL手术的瘦动物免疫组织化学染色的代表性显微照片。低功率(D类)和高功率(F类)α-SMA可见明显的小叶染色。德国：α-SMA阳性细胞的平均定量百分比/扫描的总载玻片面积，单位为μm2±各动物组的SEM，如材料和方法所述*P（P）<0.05，比较了贫BDL与非正常运行或fa/faBDL动物。原始放大倍数：×10(A–D); ×20 (E类,F类).
图3
图3
BDL手术后肝静脉中瘦素而非脂联素释放的百分比增加fa/fa以及它们的瘦弱的同窝伙伴。如材料和方法所述，采用放射免疫分析法测定瘦素和脂联素。在处死前对门静脉（PV）和肝静脉（HV）进行测量，并计算平均差值以评估平均循环瘦素和脂联素浓度。这里显示的是肝静脉中瘦素和脂联素浓度相对于门静脉瘦素或脂联素水平增加的百分数，取100%。与PV相比，只有接受BDL治疗的瘦弱窝友的HV瘦素水平显著增加1.5倍(*P（P）< 0.01). HV和PV的瘦素浓度差异在fa/faBDL组大鼠。脂联素也是如此，如图4B所示，在瘦BDL和fa/faBDL大鼠组(P（P）= 0.06;n个=每个治疗组10，瘦素浓度（单位：ng/ml）。所有来自fa/fa瘦肉组或瘦肉组进行了假手术，瘦素和脂联素在HV和PV上无差异（此处未显示数据）。
图4
图4
瘦素和α-SMA的免疫组化。如材料和方法中所述，使用双标记技术对瘦素和α-SMA进行免疫整合。α-SMA（在显微照片中标记为“肌动蛋白”）呈黑色（镍二氨基联苯胺底物），瘦素呈砖红色（新星红）。苏木精计数器染色（天蓝色）。具有代表性放大倍数的实验条件副标题的图形：FFN，fa/fa操作不当的(A类); FFB、，传真/传真胆管结扎(B类); LLN，精益半成品(C类); LLB，瘦胆管结扎(D–E型).E类演示(红色箭头瘦素；蓝色箭头，α-SMA）瘦素与α-SMA细胞的共同定位，图5用实时RT-PCR和图3A，瘦素的酶联免疫吸附测定证实了这一点（见正文）。G公司和高：分别来自LLB和LLN肝切片的无一级抗体的生物素化二级抗体。原始放大倍数，×40(G公司,H（H）).
图5
图5
RT-qPCR分析四个治疗组全肝中α1（1）胶原、α2（1）胶原蛋白、α-SMA、TGF-β1和瘦素的表达。如条形图所示，四个治疗组中每个治疗组与肝纤维化相关的关键基因的表达。从肝组织中提取的总RNA用于通过实时RT-PCR测定α1（1）胶原、α2（1）胶原蛋白、α-SMA、TGF-β1和瘦素的mRNA表达，如材料和方法中所述。观察到的瘦弱的室友的mRNA表达水平为对照组的100%。结果为平均值±标准偏差，代表每个分析基因在每个治疗条件下的12个反应*P（P）与精益半操作（对照）值相比，<0.05。
图6
图6
脂联素、α-SMA和瘦素mRNA的表达和各自的蛋白生成揭示了静止和培养激活HSC中的差异表达。答：按照文中所述进行RT-qPCR。将静止HSC中观察到的mRNA表达水平设为对照。结果为平均值±SE，代表星状细胞表型和基因分析的六个反应*P（P）与相应条件下的静止HSC相比，<0.05。B类：静止和激活HSC中脂联素、α-SMA和瘦素的免疫印迹分析。使用新鲜分离的静止和培养激活的HSC制备裂解物，并对脂联素、α-SMA和瘦素进行免疫印迹。β-肌动蛋白作为负荷控制。这些数据代表了多项独立实验。
图7
图7
AdipoR1和AdipoR2均在静止和激活的HSC中表达。答：按照材料和方法部分所述进行RT-qPCR。与静止细胞相比，AdipoR2的表达水平没有差异。B：AdipoR1和AdipoR2的免疫印迹分析证实，在静止（Q）和激活的HSC（A）中都存在各自亚型的蛋白质。所有研究均使用单独的HSC裂解物进行三次，一式三份。β-肌动蛋白作为负荷控制。
图8
图8
脂联素表达载体（pcmAdF）的转染导致HSC产生脂联素。用三种载体中的一种进行对照实验，以证明脂联素过度表达的后果和相应的对照：pcmAdF（编码全长脂联素的表位）、pcDNA3.1-U（SF条件下的空载体，0.1%）和pcDNA3.2-S（存在10%FBS的空载体）。图9所示的后续研究中也使用了向量、实验条件和命名法。免疫印迹法检测HSC和培养基中脂联素的表达，以确保HSC的表达和脂联素分泌，如图所示车道1在没有血清的情况下过表达pcDNA3.1-U的HSC中(车道2)在含有10%FBS的HSC中转染pcDNA3.1后，细胞和培养液中均未检测到脂联素，而脂联素表达极低(车道3). 分别显示了三个独立实验的密度测定法，一式三份；β-actin作为负荷控制。
图9
图9
活化HSC中脂联素过度表达显著降低活化HSC增殖和α-SMA含量。答：脂联素表达载体pcmAdF（编码全长脂联素的表位）如图8所示进行转染，发现其可减少活化的HSC-BrdU掺入。将HSC培养在96 well平板中，每孔转染0.1μg质粒DNA：pcmAdF（编码全长脂联素的表位）、pcDNA3.1-U（SF条件下的空载体）或pcDNA3.3-S（10%FBS存在下的空质粒）。转染24小时后加入BrdU，HSC在有无血清的情况下再生长48小时。如材料和方法中所述，对新合成DNA中BrdU的掺入进行免疫检测，并用分光光度法测定颜色络合物的强度。热量测定结果按照细胞数量进行标准化，并在此绘制为三次独立实验的平均值±SE。脂联素过度表达显著降低HSC增殖至10%，而在10%FBS（pcDNA3.1-S）存在下转染载体控制的HSC的增殖率显著升高*P（P）与转染对照载体（pcDNA3.1-U）的未经处理的HSC相比，<0.01。B类：脂联素载体转染HSC的SF-条件（pcmAdF-U）可降低α-SMA和PCNA的蛋白表达水平。为了确定脂联素对α-SMA和PCNA表达的影响，将HSC增殖标记物、4μg质粒DNA、pcmAdF（编码全长脂联素的表位）或pcDNA3.1（载体控制）转染到100 mm的HSC中三盘子。48小时后，制备HSC裂解物，通过十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳对总蛋白进行定量和解析，然后用α-SMA和PCNA抗体进行免疫印迹分析。β-肌动蛋白作为负荷控制。所示为相同的代表性免疫印迹以及结果的密度测定分析。
图10
图10
脂联素过度表达诱导α-SMA阳性细胞中HSC凋亡。如文中所述，将培养物激活的HSC生长在室载玻片上，并如图8和图9中所述转染。pcmAdF，编码全长脂联素的表位；pcDNA3.1，矢量控制。答：用荧光显微镜观察HSC，以鉴定脂联素和α-SMA阳性细胞；Hoechst染色检测细胞凋亡。B类：HSC的代表性荧光显微照片显示存在脂联素阳性细胞，pcmAdF的转染效率为18±1.2%；Hoechst染色显示HSC凋亡小体。抄送：脂联素阳性HSC与Hoechst阳性HSC的共放大。医生：FLAG标记的脂联素阳性细胞也与α-SMA阳性细胞共定位。所有显示的面板来自相同的微场和相同的单元(白色箭头). 条形图中显示的凋亡HSC百分比计算为凋亡细胞数/FLAG标记的脂联素阳性细胞总数，并与成功转染载体对照的凋亡细胞/HSC数（9.4%）进行比较(*P（P）< 0.01). 凋亡HSC的百分比表示三次独立实验的10个高功率场的平均值±SE。原始放大倍数，×400(A类).
图11
图11
脂联素在静止的HSC中不能诱导凋亡，但在活化的HSC却能诱导凋亡。答：分离HSC后，细胞在基质上生长以保持静止，或在塑料上生长，如材料和方法所述。通过Hoechst染色分析暴露于gAd或fAd的HSC的凋亡情况。gAd和fAd均显著诱导活化HSC的凋亡(*P（P）< 0.01).B类：为了确定caspase 3是否在活化的HSC凋亡中发挥作用，免疫印迹分析显示，脂联素处理的活化HSC导致裂解caspase 2（p19）增加，而这在静止的HSC裂解物中未检测到。本实验使用三种不同的裂解液进行。抄送：面对gAd或fAd的HSC生存能力的XTT分析表明，gAd、fAd或血清均未改变在Matrigel上生长的静止HSC的生存能力，如文中所述。然而，无论是3天龄的原代细胞还是第二代传代HSC，对任何一种脂联素的反应都显示出细胞活力显著降低(*P（P）<0.01，与在10%FBS存在下生长的相应HSC相比#P（P）<0.05，与在10%FBS中生长的相应细胞相比，3天龄的HSC）。结果代表了多个独立实验。
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