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.2005年8月；4(8):1061-71.
doi:10.1074/mcp。M400207-MCP200。 Epub 2005年5月18日。

代谢活化相关CD147-CD98复合物

徐道松 1, 马丁·海姆勒
附属公司

代谢活化相关CD147-CD98复合物

徐道松等。 分子细胞蛋白质组学. 2005年8月.

摘要

细胞表面CD147蛋白促进基质金属蛋白酶和透明质酸的产生，与单羧酸转运体和整合素相关，并参与生殖、神经、炎症和肿瘤功能。在此，我们结合共价交联、质谱蛋白质鉴定和联合免疫沉淀，显示CD147与三种主要类型的转运体（CD98重链（CD98hc）-L型氨基酸转运体、ASCT2、，和单羧酸转运体）以及细胞增殖调节器（上皮细胞粘附分子）。在这些多组分配合物的组装中，CD147和CD98hc起着中心组织作用。RNA干扰敲除实验建立了CD147和CD98hc表达之间的紧密联系，以及CD147（和CD98hc）与细胞增殖之间的紧密正相关。随着CD147-CD98hc复合物和增殖的减少，AMP激活的蛋白激酶（细胞“燃料计量器”）被激活，表明细胞能量代谢受到干扰。我们的数据表明CD147-CD98细胞表面超复合体在能量代谢中起着关键作用，可能是通过协调乳酸和氨基酸的运输。此外，我们还展示了共价交联与质谱联用如何用于鉴定密切相关的跨膜蛋白。除与CD98hc和CD147相关的蛋白外，该方法还应适用于许多其他类型的跨膜蛋白。

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数字

图1
图1
CD147相关蛋白的代表性样品。用不可还原交联剂BS3处理HT1080细胞，从1%Triton X-100裂解液中分离出CD147-FLAG复合物，然后使用还原条件（左车道）分解样品。用可还原交联剂DSP处理MCF7细胞，从1%Triton X-100裂解液中分离出CD147-FLAG复合物，并使用非还原条件（右车道）分解样品。用考马斯蓝染色后，切除指示区域进行LC-MS/MS分析。
图2
图2
交联CD147复合物含有CD98hc。A） 转染的MCF7细胞用无交联剂（1、4道）、DSP（2、5道）或BS3（3、6道）处理，并用1%Triton X-100进行裂解。使用抗FLAG抗体免疫沉淀CD147（1-3道）和对照SDFR1（4-6道），并使用pAb C-20对样本进行内源性CD98hc印迹。B） 用或不用交联剂处理转染的HT1080细胞（如在A部分中），CD147-FLAG或阴性对照（SDFR1-FLAG）进行免疫沉淀，并对样品进行内源性CD98hc印迹。C） 用或不用交联剂（如图所示）处理转染的HEK293细胞，免疫沉淀CD147-FLAG或对照SDFR1-FLAG，并对样品进行内源性CD98hc的印迹。对于面板A–C中使用的细胞，CD147-FLAG和SDFR1-FLAG的表达水平相当，如抗FLAG印迹所示（未显示）。D） 将完整的HEK293细胞交联（1 mM BS3），在1%Triton X-100中溶解，然后免疫沉淀CD147-FLAG，并对样品进行MCT1印迹。E） HEK293细胞在1%Brij 97中裂解，CD147-FLAG免疫沉淀，并对样品进行MCT1印迹。
图3
图3
CD147-CD98hc配合物的进一步表征。A） 将HEK293细胞在指定的洗涤剂（每种洗涤剂的浓度为1%）中溶解，CD147-FLAG或阴性对照SDFR1-FLAG进行免疫沉淀，并使用pAb C-20对样品进行内源性CD98的印迹。B） 对HEK293细胞进行1%Brij 99裂解，CD147-GFP（第8道）、SDFR1-GFP（第7道）或LAT1-GFP的免疫沉淀，并使用抗FLAG抗体检测CD98-FLAG（来自同一细胞裂解液）。对于反式实验中，将含有CD147-GFP的HEK293细胞（通道5）或裂解物（通道4）与含有CD98hc-FLAG的细胞或裂解物混合。然后免疫沉淀CD147-GFP，并通过印迹法检测CD98-FLAG（第4、5道）。此外，从HEK293-CD147-GFP细胞（泳道1）、HEK293-CD98-FLAG细胞（泳道2）、混合的HEK293-CD147-GFP和HEK-CD98-FLAG细胞（泳道3）以及共表达CD147-GFP和CD98hc FLAG的HEK293（泳道9）的对照裂解物中印迹CD98hc FLAG。
图4
图4
CD98hc（和LAT1）共同沉淀CD147（和MCT1）。A） 使用Triton X-100（车道1、2、4、8、9）、Brij 99（车道3、5）、CHAPS（车道6）或Brij 97（车道7）对表达CD98hc-FLAG（车道1，2，5–9）或仅表达FLAG载体（车道3，4）的HEK293细胞进行裂解。用BS3交联剂处理部分细胞（用于通道2、9）。使用抗FLAG抗体免疫沉淀CD98hc-FLAG或载体控制-FLAG后，对样本进行CD147印迹。CD147（HG）=高糖基化形式；CD147（LG）=低糖基化形式（2）。注：A部分中使用的膜首先用于C部分，然后剥离并用抗CD147抗体B10重新防护。B） 从HEK293细胞中免疫沉淀LAT1-FLAG（在Brij 99或CHAPS中裂解），并对样品进行CD147的印迹。C） 对CD98hc免疫沉淀物（如图A所示制备）进行MCT1免疫印迹。
图5
图5
CD98hc与EpCAM和ASCT2的关联。A） SW480细胞在1%Brij 99中溶解。免疫沉淀内源性EpCAM（单克隆抗体KS1/4）、CD147（单抗8G6）或Na/K ATP酶α1（单克隆疫苗C464.4），然后使用pAb C-20对内源性相关CD98hc进行印迹。B） 在1%Brij 99中裂解SW480细胞，免疫沉淀内源性CD98hc（通道2）、CD147（通道3）、EpCAM（通道4）和Na/K ATP酶-α1（通道5。C） 用交联剂（1 mM DSP）处理完整的MCF7细胞，并在1%Triton X-100中溶解。免疫沉淀和印迹内源性EpCAM、CD147和Na/K ATP酶以检测CD98hc。D） HEK293细胞在1%Brij 99或Brij 97中裂解，免疫沉淀CD147（单抗8G6）和CD98hc（单克隆抗体4F2），并用抗FLAG抗体印迹检测相关ASCT2-FLAG。
图6
图6
CD147和CD98hc的相互依赖表达。A） 对CD147 RNAi缺失的HEK293克隆的裂解液进行CD147和β微管蛋白的印迹。B） 用流式细胞术分析CD147缺失的HEK293细胞（克隆97-9）的CD147（mAb 8G6，上面板）和CD98（mAb4F2，下面板）。阴性对照细胞（虚线）用非消耗性对照RNAi处理。
图7
图7
CD147和CD98hc的功能性共同调节。A） 绘制每个CD147和CD98-RNAi缺失细胞克隆的CD98hc（y轴）和CD147（x轴）的细胞表面表达水平（以MFI单位表示）。B） 绘制CD147缺失克隆的相对增殖率与细胞表面CD147表达水平的关系。对于每个结果，N=3，SEM≤平均增殖率的5%。相对增殖率与RNAi阴性对照率相关。C） 用补充有2mM PMSF、1mM Na的蛋白酶抑制剂混合物在RIPA中裂解CD147缺失的HEK293克隆三VO（旁白）4，NaF，然后检测磷酸化AMPKα和AMPK总α的表达。使用GeneTools第3版（Syngene Laboratories，Frederick，MD）测定带密度。P-AMPK印迹中的每条带（上面板）相对于总AMPK（下面板）进行了归一化。然后将这些值相对于负控制车道进行标准化，以得出下面板下方显示的数字。
图8
图8
CD147-CD98hc超复合体的模型。图2和图4的结果支持CD147和CD98hc之间的直接关联。此外，CD147直接与MCT1和MCT4关联[（10）和图2D]，CD98hc直接与LAT1关联（31），EpCAM直接与CD98hc关联（见正文）。虽然实验一（表1）表明LAT1和EpCAM也可以直接接触CD147，但这种可能性在进一步的实验中没有得到证实。表1中的实验表明ASCT2可以接触CD147和CD98。随后的实验结果目前支持CD98hc接触，但ASCT2-CD147接触仍有可能。
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