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比较研究
.2005年5月24日；102(21):7595-600.
doi:10.1073/pnas.0500663102。 Epub 2005年5月13日。

二酰甘油激酶iota调节Ras鸟苷释放蛋白3并抑制Rap1信号

黛布拉·斯雷吉尔 1, 杰瑞德·希格比, 卡特里娜·M·隆德, 富米奥·萨卡内, 斯蒂芬·普雷斯科特, 马修·托帕姆
附属公司
比较研究

二酰甘油激酶iota调节Ras鸟苷释放蛋白3并抑制Rap1信号

黛布拉·S·里吉尔等人。 美国国家科学院程序. .

摘要

为了研究将二酰甘油（DAG）激酶iota（DGKiota）转化为磷脂酸的生理功能，我们在小鼠中删除了该基因。与先前的研究显示DGK亚型降低Ras活性相反，在缺乏DGKiota的细胞中，胚胎成纤维细胞中Ras下游的信号传导显著减少。DGK通过减弱依赖DAG的Ras鸟嘌呤核苷酸释放蛋白（RasGRP）的功能来调节Ras信号。我们测试了DGKiota是否抑制四种已知的RasGRP，发现它只抑制RasGRP3。除了激活Ras外，RasGRP3还激活Rap1，在某些情况下可以对抗Ras的功能。我们证明DGKiota与RasGRP3结合，并通过代谢DAG抑制Rap1的激活。这种抑制作用因此影响Ras信号传导。我们通过将野生型或缺乏DGKiota的小鼠与携带v-Ha-Ras转基因的小鼠杂交，测试删除DGKiota的生理后果，然后评估肿瘤形成。我们观察到DGKiota缺乏小鼠的肿瘤明显减少。由于Rap1可以拮抗Ras的功能，我们的数据与DGKiota调节RasGRP3并对Rap1活性产生主要影响的模型一致。此外，我们发现结构类似于DGKiota的DGKzeta抑制RasGRPs 1、3和4，并主要影响Ras信号。因此，IV型DGK调节RasGRP，但下游影响因DGK而异。

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数字

图1。
图1。
通过同源重组产生DGKⅠ缺陷动物。(A类)带有胸苷激酶（TK）和新粘菌素耐药盒的DGKⅠ敲除靶向载体。EcoRI用于Southern印迹，阴影框代表探针。图中还显示了用于基因分型的PCR引物（箭头）和PCR产物的大小。(B类)利用尾部裂解物的基因组DNA进行PCR检测动物的基因型。(C类)RT-PCR分析野生型（+/+）或敲除型（-/-）小鼠肝脏的mRNA，以检测DGK l mRNA的表达。
图2。
图2。
IV型DGK对Ras信号有不同的影响。来自野生型、，dgki公司–/–(A类)，或dgkz（千兆赫兹）–/–(B类)用PathDetect质粒构建物转染小鼠胚胎并饥饿过夜。然后用血小板衍生生长因子（PDGF，5.5 h，40 ng/ml）处理它们，并检测荧光素酶活性。所示数据为平均值+SE(n个= 4–6).*,P（P）与野生型相比，<0.05。
图3。
图3。
DGKⅠ选择性抑制RasGRP3。(A类)用RasGRPs和空载体（-）、Flag-DGKζ或Flag-DGκ转染HEK293细胞。24–48小时后，使用GST-RBD下拉分析检测活性Ras（Ras-GTP）或Rap1（Rap1-GTP）。总细胞裂解物用于评估总Ras、Rap1和DGK(n个=每个实验2-6）。(B类)用所示的构建物转染HEK293细胞。48小时后，Rap1-GTP或Ras-GTP亲和沉淀，然后通过Western blotting检测。使用扫描密度计对数据进行分析，结果表明活性Rap1或活性Ras归一化为总Rap1，或裂解物+SE中的Ras(n个= 3).
图4。
图4。
DGKⅠ与RasGRP3和Rap1共定位和共免疫沉淀。(A类)人类肾脏切片用DGK l或RasGRP3特异的正或反义RNA探针孵育。蓝色信号表示远端卷曲小管中两种蛋白的mRNA。肾小球中几乎没有表达。感官（阴性）控制中的信号最小（数据未显示）。(B类)用抗HA抗体沉淀转染所示质粒的HEK293细胞的细胞裂解物。用SDS/PAGE分离裂解产物或沉淀蛋白，然后用Western blotting检测DGKⅠ和RasGRP3(n个= 2–4). (C类)用所示质粒转染HEK293细胞。用抗Rap1抗体进行免疫沉淀，然后用Western blotting检测DGK l和Rap1(n个= 3).
图5。
图5。
DGKⅠ通过RasGRP3调节Rap1活性。(A类)用PathDetect质粒RasGRP3和DGK？或激酶缺失DGK？转染HEK293细胞。48小时后，测定荧光素酶活性，然后将其归一化为总蛋白。所示数据为平均值+SE(n个= 5;*,P（P）与对照组相比<0.05）。(B类)将永生胚胎成纤维细胞饥饿过夜，然后用2单位/ml的凝血酶处理。通过亲和沉淀和Western印迹检测活性Rap1和Ras(n个=每种情况2–3）。(C类)如上所述处理永生野生型DGKζ基因敲除或DGK½基因敲除了的胚胎成纤维细胞，然后通过Western blotting测定磷酸化ERK和总ERK水平(n个= 3).
图6。
图6。
DGK l的缺失增强了Ras依赖性肿瘤的形成。TG.AC公司+/dgki公司+/+或TG.AC+/dgki公司–/–对动物进行为期8周的PMA治疗，每周三次(A类,n个=每种情况8个）或遭受全层伤害(B类,n个=每种情况22–25，在20周时评估肿瘤）。*,P（P）与溶媒对照动物相比，<0.05。(C类)利用亲和沉淀法，在一个TG.AC的自发性口腔肿瘤中测定活性Rap1的水平+/dgki公司+/+或一台TG.AC+/dgki公司–/–动物。
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