Deletion of M2 gene open reading frames 1 and 2 of human metapneumovirus: effects on RNA synthesis, attenuation, and immunogenicity

doi:10.1128/JVI.79.11.6588-6597.2005

.2005年6月；79(11):6588-97.

doi:10.1128/JVI.79.11.6588-6597.2005。

人偏肺病毒M2基因开放阅读框1和2的缺失：对RNA合成、衰减和免疫原性的影响

乌苏拉·J·巴赫霍尔茨¹, 圣埃芬·比亚切西, Quynh N Pham公司, Kim C Tran先生, 杨丽娟, 辛迪·隆戈, 马里奥·H·斯基亚多普洛斯, 布莱恩·墨菲, 彼得·柯林斯

附属机构

PMID： 15890897
预防性维修识别码：邮编112115
DOI（操作界面）： 10.1128/JVI.79.11.6588-6597.2005

人偏肺病毒M2基因开放阅读框1和2的缺失：对RNA合成、衰减和免疫原性的影响

乌苏拉·J·巴赫霍尔茨等。 J维罗尔. 2005年6月.

.2005年6月；79(11):6588-97.

doi:10.1128/JVI.79.11.6588-6597.2005。

作者

乌苏拉·J·巴赫霍尔茨¹, 圣埃芬·比亚切西, Quynh N Pham公司, Kim C Tran先生, 杨丽娟, 辛迪·隆戈, 马里奥·H·斯基亚多普洛斯, 布莱恩·墨菲, 彼得·柯林斯

附属

¹美国马里兰州贝塞斯达国立卫生研究院国家过敏和传染病研究所传染病实验室，邮编：20892-8007。ubuchholz@niaid.nih.gov

PMID： 15890897
预防性维修识别码：项目经理1112115
DOI（操作界面）： 10.1128/JVI.79.11.6588-6597.2005

摘要

人偏肺病毒M2基因包含两个重叠的开放阅读框，即M2-1和M2-2。证实了从这些ORF中分离出的M2-1和M2-2蛋白的表达，并恢复了重组HMPVs，其中M2-1和M3-2的表达被单独或一起消融[rdeltaM2-1、rdeltaM3-2和rdeltaM1（1+2）]。每一种M2突变病毒都能在Vero细胞中引导高效的多周期生长。缺乏M2-1的HMPV的恢复能力与人类呼吸道合胞病毒形成对比，M2-1是人类呼吸道合细胞病毒的重要转录因子。当上游M2-1 ORF的翻译被沉默时，下游HMPV M2-2 ORF的表达没有减少，表明它是单独启动的。rdeltaM2-2突变体的mRNA积累量增加了两到五倍，与基因组模板一致，表明M2-2在调节RNA合成中起作用。在仓鼠中测试复制和免疫原性。经鼻感染rdeltaM2-1或rdeltaM1（1+2）的动物在感染后第3天或第5天的肺部或鼻甲中没有可恢复的病毒，也没有产生HMPV中和血清抗体或对HMPV挑战的抵抗。因此，M2-1似乎对病毒在体内的显著复制至关重要。在感染rdeltaM2-2的动物中，仅在12只动物中的1只中发现病毒，仅在一天内在鼻甲中发现病毒。然而，所有动物都产生了高滴度的HMPV-中和血清抗体，并对野生型HMPV的攻击具有高度保护。HMPV rdeltaM2-2病毒是一种有希望的高度减毒HMPV疫苗候选。

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数字

**图1。**
HMPV M2基因缺失突变体概述。（A） HMPV基因组图（顶部；比例尺近似）和引入的突变。ORF显示为开放矩形，氨基酸长度如下所示。用于克隆的限制位点的位置如上所示；PacI和KpnI位点是天然存在的，NheI和BsiWI位点（盒装）是通过定点突变产生的（参考文献和本研究）。图中还显示了一个额外的基因，该基因编码如前所述构建的增强型GFP基因（5）：对于每个突变体，分别在添加和不添加该GFP基因的情况下生成一个版本（例如，rgHMPV和rHMPV）。放大显示含有M2基因的PacI-BsiWI片段，ORF显示为开放矩形，括号中显示氨基酸长度；基因开始和结束信号分别显示为黑色三角形和矩形。沉默ORF的突变包括引入的终止密码子（恒星）、M2-2 ORF的部分缺失或M2基因的全部缺失（在ΔM2（1+2）的情况下）以及基因间（ig）区域的13 nt。框中列出了修改后的M2基因的核苷酸长度。用RT-PCR分析重组病毒。从感染重组体的Vero细胞中分离出总细胞RNA。第一链合成是使用横跨HMPV nt 4656到4676的第一链引物完成的。使用相同的引物和横跨HMPV nt 5529至5508的反向引物进行PCR，并在2%琼脂糖凝胶（面板a右侧）上分离产物，以确认存在缺失。（B）沉默M2-1和M2-2 ORF的突变细节。HMPV的M2-1 ORF上游末端（HMPV nt 4724至4768）显示与M2-1消融表达相关的突变（顶框）。M2-2 ORF的上游端与M2-1 ORF的下游端重叠（HMPV nt 5234至5288），显示M2-2（底部框）的消融表达涉及突变。野生型序列位于每个框的顶部，引入的更改如下所示。翻译开始和结束密码都是黑体字。在氨基酸水平上，终止密码子显示为星星。ΔM2-2突变体中涉及的缺失的上游端显示为（Δ）。编码蛋白的身份如右图所示。

**图2。**
对用表达质粒转染或感染野生型或突变型HMPV的细胞中表达的HMPV蛋白进行Western blot分析。（A）用质粒pT7-N、pT7-P或pT7-M2-1转染稳定表达T7 RNA聚合酶的BHK-21细胞，在T7启动子（5）的控制下携带指示的HMPV ORF（分别为1到3通道）。或者，Vero细胞在1个PFU/cell的输入MOI下感染rHMPV、rΔM2-1、rΔM2-2、r△M2（1+2）或HMPV CAN97-83，或者被模拟感染（分别为通道4至9）。在转染或感染后72 h收获细胞，制备裂解物，并在还原和变性条件下使用4-12%梯度凝胶进行十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳。将Western blot转移到硝化纤维素后，将膜与纯化HMPV（5，6）的兔超免疫血清孵育，然后与辣根过氧化物酶结合的山羊抗兔抗体孵育。结合抗体通过化学发光显示。N、P和M2-1蛋白以及可能与M蛋白对应的物种都被标记。（B）感染带有或不带有与M2-2蛋白融合的HA表位标签的GFP表达重组体72小时后，获取Vero细胞细胞裂解物的Western blot。将膜与HMPV（上面板）的高免疫血清或HA表位（HA-7；Sigma）的小鼠单克隆一级抗体（下面板）孵育。

**图3。**
细胞内HMPV M2 RNA的Northern blot分析。将感染了野生型和M2突变型病毒并为图2所示实验采集的一等分Vero细胞用于分离细胞内总RNA。细胞感染rHMPV、rΔM2-1、r△M2-2和rΔM1（1+2），或HMPV CAN97-83病毒或被模拟感染（分别为1至6道）。RNA在含有0.44 M甲醛的1%琼脂糖凝胶上电泳，转移到尼龙膜上，并与[α-³²P] HMPV M2特异的标记双链DNA探针。用荧光成像仪检测放射性。单反子M2信使核糖核酸和M2-SH和M2-SH-G读通信使核糖核酸（5，6）在右边被鉴定。

**图4。**
细胞内HMPV RNA积累的Northern印迹时程分析。用rgHMPV或指示的M2突变体感染Vero细胞的复制培养物，并在12、24、36、48和72小时后收获。分离细胞内总RNA，如图3图例所示进行分离，并分别使用SP6和T7 RNA聚合酶从F cDNA体外合成的单链负义（上面板）和正义（下面板）RNA探针通过Northern杂交进行分析。

**图5：。**
（A） rgHMPV和M2突变体的多步生长动力学比较。Vero细胞在0.01 PFU/cell的MOI下感染rgHMPV、rgΔM2-1、rg△M2-2或rg△M2（1+2）。每隔24小时，取培养基样品（0.5 ml的2-ml覆盖物），并用等量的含有5μg/ml胰蛋白酶的新鲜培养基代替。样本通过斑块分析和抗HMPV抗血清免疫染色进行分析。每个时间点由两个孔表示，每个病毒滴定重复进行。显示了平均值。（B）在感染后4天，以0.03的MOI用所示重组体对Vero细胞进行间接免疫荧光检测。细胞用4%缓冲多聚甲醛固定，并用1%Triton X-100渗透。用兔对HMPV的高免疫血清观察HMPV抗原，然后用Alexa488-结合的山羊抗兔抗体（分子探针）。用4′，6-二氨基-2-苯基吲哚（DAPI；Sigma）进行核染色质染色（蓝色）。

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