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.2005年5月；25(10):4272-82.
doi:10.1128/MCB.25.10.4272-4282.2005。

SUMO中一个较小的保守表面是其转录抑制特性的关键结构决定因素

谢尔盖·丘普雷塔 1, 萨姆·霍姆斯特伦, 拉利塔·苏布拉曼尼亚（Lalitha Subramanian）, Jorge A Iñiguez Lluhí
附属公司

SUMO中一个较小的保守表面是其转录抑制特性的关键结构决定因素

谢尔盖·丘普雷塔等。 分子细胞生物学. 2005年5月.

摘要

序列特异性转录因子的小泛素样修饰物（SUMO）修饰具有深刻的调节作用。通过提供内在抑制功能，SUMO亚型可以抑制转录激活，特别是在含有多个响应元件的启动子处。通过全面的结构-功能分析，我们沿着SUMO2的第二个β表和下面的α螺旋确定了一个单一的关键扇区。这种独特的表面由四种基本残基（K33、K35、K42、R50）定义，它们围绕着由脂肪族（V30、I34）和极性（T38）残基组成的浅口袋。该区域内的取代作用特别显著地影响了SUMO2和SUMO1抑制转录的能力，并揭示了关键基本残基的正电荷性质是其功能作用的主要特征。这种高度保守的表面解释了SUMO对多个转录因子和启动子环境的抑制特性，并可能定义了介导SUMO抑制特性的辅抑制因子的相互作用表面。

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图1。
图1。
鉴定与GR活性抑制有关的SUMO2残基反式（a）SUMO2中单个丙氨酸取代对SUMO2-Gal4融合体抑制配体活化SC突变体GR能力的影响反式pΔ（Gal）2（周转时间）1-Luc记者。钢筋的着色取决于相应残留物的预计表面暴露。确认Gal4融合蛋白表达的免疫印迹数据如下图所示。GR的示意图强调了N末端激活域（AF-1）内的两个SC/SUMO基序。SC突变形式的Lys-to-Arg突变如WT序列所示。还显示了DBD和配体结合域（LBD）。Δ（Gal）2（周转时间）1-Luc记者也被示意化了。数据表示至少三次重复或三次独立实验的平均±SEM，并表示为SC突变GR活性的百分比（4.9±0.4）。（b） SUMO和相关Ubl蛋白的序列比对。仅显示面板a中测试的残留物。着色基于残留物类型。次要结构构件的位置显示在路线下方。
图2。
图2。
功能相关残基在SUMO2表面的不同区域聚集。显示了SUMO2同源模型的带状和填充表示的前视图（a）和后视图（b）。最左边两个面板的颜色根据图1中的数据确定，并按照中央面板下方显示的比例进行标准化，范围从无影响（绿色）到最有害（红色）。预计暴露或未测试（NT）低于10%的埋藏（B）残留物分别显示为深蓝色和浅蓝色。在最右边的两个面板中，着色是根据计算出的从红色（负）到蓝色（正）的静电势以及多个物种之间的相对（相对）守恒来进行的。与Ubc9和SENP2结合有关的残基，以及特定的相关残基，如箭头所示。术语，终点。
图3。
图3。
K33、K35、K42和R50的正电荷是SUMO2介导的GR活性抑制的关键特征反式和中顺式（a）SUMO2选择碱基残基上的取代对SUMO2-Gal4融合子抑制SC突变体GR能力的影响反式（b）相同取代对SUMO2抑制转录能力的影响顺式当在SC突变体GR的N末端融合时，用10 nM地塞米松处理细胞，并按照材料和方法中的描述进行处理。报告质粒的图表显示在相应的面板上方，融合蛋白的表达水平（抗HA免疫印迹）如下所示。对于面板a和面板b，数据表示至少三个独立实验的平均±SEM，一式三份，并表示为SC突变GR活性的百分比，在pΔ（Gal）下分别为5.7±0.57和190±22（周转时间）1-Luc和pΔ（TAT）三-Luc分别表示。
图4。
图4。
复合突变严重影响SUMO2对GR激活转录的抑制反式和中顺式（a）SUMO2多个位置的取代对SUMO2-Gal4融合子抑制SC突变GR能力的影响反式pΔ（Gal）2（周转时间）1-Luc记者。（b） 相同取代基对SUMO2抑制细胞凋亡能力的影响顺式当在SC突变体GR的N末端pΔTAT融合时三-Luc记者。用10 nM地塞米松处理细胞，并按照材料和方法中的描述进行处理。每个面板中间和底部的参考线分别指示K42A和K42E突变的活性。通过HA表位的Western blot检测证实了相应融合蛋白的表达水平。在面板a和面板b中，数据表示至少三次独立实验的平均±SEM，一式三次，并表示为SC突变GR活性的百分比，在pΔ（Gal）下分别为5.7±0.57和222±172（周转时间）1-Luc和pΔ（TAT）三-Luc分别表示。
图5：。
图5：。
SUMO2转录调控表面的破坏影响多剂量和启动子环境下的抑制。（a） 用WT（阴影符号）或SC突变（开放符号）GR的表达载体和Gal4 DBD融合到HA标记的NEDD8（正方形）、WT SUMO2（三角形）或SUMO2 K33E/K42E突变（菱形）的指示数量的表达载体转染细胞。报告质粒为pΔ（Gal）2（周转时间）1-Luc（左）和pΔ（Gal）2（周转时间）三-吕克（右）。（b） 用指示量的基于p6R的载体转染细胞，用于表达WT GR（阴影圆圈）、SC突变体GR（开放正方形）或与WT SUMO2融合的SC突变体GR（开放三角形）或SUMO2 K33E/K42E突变体（开放菱形）。使用的报告质粒为pΔTAT1-Luc（左）和pΔTAT三-吕克（右）。在面板a和面板b中，数据表示至少三次独立实验的平均±SEM，一式三份，并表示为SC突变GR活性的百分比，如下所示：pΔ（Gal）2（周转时间）1-Luc为10.8±1.4；pΔ（加仑）2（周转时间）三-吕克，799±100；pΔ（TAT）1-Luc，3.3±0.2；pΔ（TAT）三-吕克，471±24。
图6。
图6。
与SUMO2介导的转录抑制有关的残基在SUMO1中功能保守。（a） SUMO1和SUMO2同源位置突变对相应HA-SUMO-Gal4融合子抑制SC突变GR能力的影响的比较反式pΔ（Gal）2（周转时间）1-Luc记者。（b） 相同突变对SUMO1或-2抑制转录能力的影响顺式当在pΔTAT的SC突变体GR的N末端融合时三-Luc记者。在每个面板中，数据表示至少三个独立实验的平均±SEM，一式三份，并表示为pΔ（Gal）下SC突变GR活性的百分比2（周转时间）1-Luc（8.4±1.9）或pΔ（TAT）三-Luc分别为（326±37）。
图7。
图7。
SUMO2的抑制表面影响多种激活剂。SUMO2抑制表面作用于多种激活剂的能力在反式来自pΔ（Gal）的SC突变CEBPα（K159R）2（中国民航局）2-来自pΔ（Gal）的Luc报告基因（a）和SC突变雄激素受体（K385E/K518E）2（TAT）三-Luc（b），使用所指示的Gal4-DBD融合。（c） 在-顺式在pΔ（Gal）下测试WT或K33E/K42E SUMO2与Gal4-VP16的融合2-吕克。用100 nM二氢睾酮处理组b中的细胞。数据表示至少三次独立实验的平均±SEM，一式三份，并表示为相应活化剂单独活性的百分比，如下所示：pΔ（Gal）2（中国民航局）2-Luc，54±2；pΔ（Gal2）2（周转时间）三-Luc，60±5；pΔ（加仑）2-吕克，300±35。Vec，矢量。
图8。
图8。
受到抑制的SUMO2突变体仍然活跃于加工和接合。（a） 通过转染CV-1细胞表达HA-SUMO2与Gal4 DBD的融合，在SUMO2 C末端（末端）和Gal4 DB之间的连接处含有（+）或缺乏（−）Gly-Gly（GG）基序。总细胞裂解物通过SDS-PAGE进行解析，亲本和加工形式通过HA表位的免疫印迹检测。（b） 在体外翻译和35如材料和方法所述，在GST下拉试验中，对缺乏N-末端SUMO化位点（Δ1-16）或与K33E/K42E突变结合的S-标记SUMO2蛋白与固定化Ubc9的相互作用进行测试。（c） 表达HA标记和预处理（GG停止）WT或突变体（K33E/K42E）SUMO2的细胞中SUMO缀合物的模式。总细胞裂解物通过SDS-PAGE溶解，SUMO结合物通过HA表位免疫印迹检测。显示了用于每个实验的各种SUMO形式的示意图。显示了标准物的位置和分子质量（单位：千道尔顿）。
图9：。
图9：。
SUMO1、SUMO2和SMT3中压制表面的结构比较。显示了SUMO2（左）、SUMO1（中）和SMT3（右）晶体结构中转录抑制表面的前视图（a）和侧视图（b）。由关键功能残基定义的溶剂可及表面叠加在每个蛋白质的带状图上。计算出的静电势映射到每个表面上，临界苏氨酸残基（SUMO2中的T38）占据的区域用黄色表示，疏水孔的位置用虚线勾勒出来。侧视图中，苏氨酸残基缺失，以突出SUMO1和-2中关键碱基残基的平行间距相似但方向不同。
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