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.2005年8月1日；389（第3部分）：745-51。
doi:10.1042/BJ20050083。

小鼠氨基酸转运蛋白B0AT1（slc6a19）的特性

克里斯托夫·伯默 1, 安吉丽卡·布罗尔, 迈克尔·蒙津格, 索尼娅·科瓦尔祖克, 约翰·E·J·拉斯科, 弗洛里安·朗, 斯特凡·布勒尔
附属公司

小鼠氨基酸转运蛋白B0AT1（slc6a19）的特性

克里斯托夫·伯默等。 生物化学杂志. .

摘要

利用双电极电压灯技术和爪蟾卵母细胞表达系统中的示踪剂研究详细研究了小鼠（m）B0AT1（slc6a19）转运蛋白的机制。所有中性氨基酸均在生理电位下诱导内向电流，但大的中性非芳香氨基酸是mB0AT1的首选底物。底物以约1mM至约10mM的K0.5值进行转运。转运蛋白以1:1的化学计量介导Na+-氨基酸共转运。转运机制中没有其他离子参与。细胞外Na+浓度的增加降低了亮氨酸的K0.5，反之亦然。此外，两种底物的K0.5值和Vmax值随膜电位的变化而变化。因此，K0.5和Vmax值是底物和共底物浓度以及膜电位的复杂函数。提出了一个模型，假设三元[Na~+-底物-转运子]络合物具有随机结合顺序和正电荷，这与实验数据一致。

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数字

图1
图1。亮氨酸诱导的内向电流的电压依赖性
表达mB的卵母细胞0将AT1 cRNA孵育5天，然后以−60 mV的保持电位与5 mM亮氨酸过度融合。在建立稳定的内向电流后，保持电位在−150 mV和+50 mV之间以10 mV的步长变化。(A类)在缺乏和存在5 mM亮氨酸的情况下获得的原始轨迹。(B类)作为保持电位函数的净亮氨酸诱导电流(n个=10个卵母细胞）。
图2
图2。小鼠B的底物特异性0自动变速箱1
表达mB的卵母细胞0AT1 cRNA孵育5-8天。随后，将卵母细胞保持在−50 mV的膜电位下，然后单独使用ND96（pH 7.4）或最终浓度为5 mM的含有不同氨基酸的ND96（PH7.4），或使用0.3 mM的胱氨酸（如果是胱氨酸）。每个条形代表平均值±S。第D.页，共页n个>每个氨基酸来自不同批次的7个卵母细胞。数据来自不同批次的卵母细胞，并归一化为5 mM亮氨酸诱导的电流。
图3
图3。氨基酸诱导电流与底物浓度的关系
表达mB的卵母细胞0AT1 cRNA孵育5天。随后，将卵母细胞分别与ND96（pH 7.4）或含有不同氨基酸（▼亮氨酸；▲ 丙氨酸；● 甘氨酸；◆ 谷氨酰胺；■ 苯丙氨酸），使用0.1、0.3、1、3和10mM的浓度(A类). 在达到稳态电流后，保持电位在−60 mV和−140 mV之间变化，步长为10 mV，从而得出K（K）0.5值(B类)和我最大值值(C类)在不同的保持电位下。每个基准点代表平均值±S。E.运输活动n个=17–21个卵母细胞。
图4
图4。亮氨酸转运作为Na的函数+浓度
卵母细胞注射mB0AT1 cRNA或在对照组中保持未注射状态，并孵育5-8天。[14C] 在Na下测定亮氨酸摄取量（100μM；○）+浓度范围为0–100 mM（所有pH值为7.4）。每个基准点代表平均值±S。D.运输活动n个=10个卵母细胞。减去未注射卵母细胞的转运活性（实验重复三次）。使用双电极电压钳，在Na下测定亮氨酸诱导电流[5 mM（●）和30 mM（■）]+浓度范围为0–100 mM（所有pH值为7.4）。每个基准点代表平均值±S。第页，共页n个=5个卵母细胞。用三批不同的卵母细胞重复实验。电流被标准化为最大电流。
图5
图5。pH值对亮氨酸通过mB转运的影响0自动变速箱1
每个卵母细胞注射mB0AT1 cRNA（23 ng）、rMCT1 cRNA（10 ng）、rMCT1（10 ng0AT1（23 ng）cRNA，或在对照组中保持未注射状态。(A类)吸纳L（左）-[14C] 乳酸（100μM，左侧面板）和L（左）-[14C] 在表达rMCT1、mB的卵母细胞中研究亮氨酸（100μM，中间板）0AT1、rMCT1和mB0AT1和在未注射卵母细胞中证明两种转运蛋白的活性表达。为了研究细胞内酸化的影响[14C] 通过与30 mM乳酸孵育降低细胞内pH值后，研究亮氨酸摄取（100μM，右图）。(B类)卵母细胞注射最终浓度为10 mM[14C] 亮氨酸。随后，研究了在50 mM KCl存在下，不同细胞外pH测量值下的亮氨酸流出，以通过去极化增强流出。每个基准点代表平均值±S。D.运输活动n个=5个卵母细胞（实验重复三次）。减去未注射卵母细胞的转运活性。结果来自注射后5-8天进行的实验。
图6
图6。mB中衬底和共衬底之间的相互作用0表达AT1的卵母细胞
卵母细胞注射mB0AT1 cRNA并孵育5天。随后，卵母细胞被保持在−50 mV的膜电位下，并在ND96（▼）或ND96中过量注入不同浓度的亮氨酸，其中90 mM NaCl（●）或70 mM NaCl（○）被NMDG-Cl取代。
图7
图7。mB的动力学参数0AT1活性与膜电位和细胞外亮氨酸浓度的关系
每个卵母细胞注射23 ng mB0AT1 cRNA(A类)孵育5天后，将卵母细胞与ND96（pH 7.4）或ND96混合，其中NaCl被NMDG-Cl取代，以达到指定的浓度。5 mM亮氨酸诱导内向电流。保持电位以10 mV的步长从−60 mV变为−140 mV。每个基准点代表平均值±S。第E页，共E页n个=22个卵母细胞。计算的K（K）0.5值(B类)和我最大值值(C类)根据保持电位绘制。
图8
图8。小鼠B的动力学方案0AT1运输机
动力学模型显示了四种状态：空载载体和满载载体，结合位点朝向胞浆（'）或细胞外空间（“）。载体本身名义上不带电。为了简单起见，假设膜的两侧都发生了随机结合/解除结合，尽管支持这一点的功能数据仅适用于外侧面。标记了受pH值或膜电位变化影响的步骤。AA，氨基酸。
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