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比较研究
.2005年3月16日；25(11):2793-802.
doi:10.1523/JNEUROSCI.4090-04.2005。

二硫化物异构酶Grp58是防止朊病毒神经毒性的保护因子

克劳迪奥·赫茨 1, 米琳·拉塞拉基斯·卡内罗, 塞巴斯蒂安·瓦尔切利, 索尼娅·卡博尼, 伊丽莎白·维亚尔·尼赫特（Elisabeth Vial-Knecht）, 金西·蒙德雷尔, 约阿金·卡斯蒂利亚, 苏托
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比较研究

二硫键异构酶Grp58是对抗朊病毒神经毒性的保护因子

克劳迪奥·赫茨等。 神经科学. .

摘要

朊病毒疾病是一种遗传性神经退行性疾病，其特征是广泛的神经元凋亡和错误折叠的朊蛋白（PrP（SC））的积累。最近的报道表明，PrP（SC）通过激活内质网（ER）应激途径和内质网内caspase-12诱导神经元凋亡。在这里，我们在小鼠羊瘙痒模型中研究了朊病毒复制与疾病不同阶段内质网应激诱导之间的关系。观察到的第一个变化包括葡萄糖调节蛋白Grp58的ER伴侣上调，该蛋白在症状前阶段检测到，紧随PrP（SC）的形成。Grp58表达的增加与PrP（SC）在疾病各个阶段在不同脑区的积累相关，表明这种伴侣蛋白可能在细胞对朊病毒感染的反应中发挥重要作用。事实上，使用N2a神经母细胞瘤细胞进行的体外研究表明，用小干扰RNA抑制Grp58表达可显著增强PrP（SC）毒性。相反，Grp58的过表达保护细胞免受PrP（SC）毒性的影响，并降低胱天蛋白酶12的激活率。Grp58和PrP通过共免疫沉淀相互作用，在感染羊痒朊病毒的细胞中观察到更高的相互作用。我们的数据表明，Grp58的表达是对朊病毒复制的早期细胞反应，是抵抗朊病毒神经毒性的神经保护因子。我们的研究结果表明，以Grp58相互作用为靶点可能有助于开发治疗和早期诊断朊病毒疾病的新策略。

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数字

图4。
图4。
Grp78和Grp94是由139A羊痒病感染暂时诱导的。A类,B类，第78组(A类)和Grp94(B类)通过Western blotting测定12、16和20wpi时的表达水平，并通过密度测定法定量三种不同感染动物的条带强度。顶部，16和20 wpi的代表性Western blot分析。将Grp78和Grp94的底部平均强度与三只对照动物的相应值进行比较。以脑区和注射后周为变量进行双向方差分析，结果显示Grp78和Grp94的表达水平没有显著差异。t吨个别值的测试分析显示出一些统计上的显著差异(*第页< 0.05;**第页< 0.01). Cx，皮层；髋，海马；Thal，丘脑；BS，脑干。C类通过Western blotting（左）分析20 wpi时不同脑区的Calnexin、Hasp70、Hsp60和GADD153/CHOP水平，并按照A类和B类（右）。
图6。
图6。
Grp58保护N2a细胞对抗PrP联合国安全理事会毒性。A类用不同浓度的纯化PrP处理转染Grp58siRNA、模拟siRNA或全长Grp58的N2a克隆联合国安全理事会48 h后通过MTS分析测定细胞活力。数据由Student’s分析t吨比较模拟转染细胞与过度表达Grp58或转染Grp58siRNA的细胞之间的差异。*第页< 0.05;**第页< 0.01.B类，同时，用PrP处理细胞联合国安全理事会Western blot分析检测caspase-12的活性。肌动蛋白水平显示为蛋白质负荷的内部控制。C类转染Grp58siRNA、模拟siRNA或全长Grp58（OE）的N2a克隆用50 n米PrP公司联合国安全理事会或800 ng/ml衣霉素48 h，通过Western blot分析测定GADD153/CHOP和肌动蛋白水平。
图1。
图1。
139A小鼠瘙痒模型中的疾病进展和朊病毒繁殖。A类每组8只动物在海马内注射1μl来自正常（对照）或139A羊瘙痒感染小鼠的10%脑匀浆。肌肉力量是通过测量动物能够抓住倒置烤架的时间来确定的。数值表示倒置后1分钟内倒下的各组动物的百分比。B类Western blot分析16wpi后对照组和感染组不同脑区总PrP水平。微管蛋白水平被用作蛋白质负荷的内部控制。Cx，皮层；髋，海马；Thal，丘脑；理学学士，脑干。D、 M和N分别代表二糖基化、单糖基化和非糖基化形式的PrP。C类PrP的Western blot分析联合国安全理事会在12、16和20 wpi的感染动物的PK消化脑匀浆中。显示了每组三只不同动物的结果。作为对照，正常脑匀浆用PK处理或不处理。D类，PrP的量化联合国安全理事会羊瘙痒感染动物不同脑区的水平占总PrP的百分比C类在对照动物中。PrP中的差异联合国安全理事会累积具有统计学意义(第页<0.001），以脑区和注射后周为变量进行双向方差分析。
图2。
图2。
Grp58在139A感染动物的早期大脑中上调，并与PrP相关联合国安全理事会水平。A类，第58组和PrP联合国安全理事会用Western blot分析16wpi时不同脑区的水平。B类通过定量Western blot分析在疾病不同阶段采集的脑匀浆，测定Grp58的表达水平，并取三只动物的结果平均值。在注射后的不同时间，对不同的大脑区域测定来自感染动物和正常动物的Grp58信号的比率。结果代表三种不同动物的平均±SD。Grp58表达水平的差异具有统计学意义(第页<0.01），以脑区和注射后周为变量进行双向方差分析。Cx，皮层；髋，海马；Thal，丘脑；BS，脑干。C类、PrP水平联合国安全理事会和Grp58从所述的所有脑匀浆中进行比较B类和图1E类.
图3。
图3。
Grp58的神经表达。A类用抗Grp58（红色荧光）和抗NeuN（绿色荧光）对来自对照组和羊瘙痒感染动物的丘脑切片进行联合免疫。右侧面板显示NeuN和Grp58染色的叠加。B类，放大从感染羊瘙痒病的动物身上获得的两张照片，如中所述A类.C类，在没有初级抗体的情况下进行的对照实验。相控图显示为控制。
图5。
图5。
阻断Grp58的表达会增加N2a细胞对某些形式内质网应激的敏感性。A类获得了不同的N2a亚克隆，这些亚克隆稳定地转染了针对Grp58 RNA（RNAi）、无关siRNA（mock）或Grp58表达质粒（OE）的载体siRNA。通过Western blot分析几个不同克隆中Grp58、Grp94、PDI、calnexin和actin的表达水平。B类用衣霉素（T）或布氏菌素A（B）处理后测定Grp58、Grp78和Grp94（top）的诱导水平。同时，在相同的样品中测定caspase-12的激活情况（底部）。测定肌动蛋白水平作为适当蛋白质负荷的对照。C类用不同浓度的衣霉素处理转染Grp58siRNA或模拟siRNA的三个不同克隆，48h后通过MTS分析测定细胞活力。衣霉素对Grp58siRNA细胞死亡的影响存在显著差异(第页<0.0001）与单向ANOVA分析的对模拟转染细胞的影响进行比较。D类，一个转染Grp58siRNA或模拟siRNA的代表性克隆用不同浓度的brefeldin A处理。单向方差分析发现效果显著不同(第页<0.01）。E类，用5或20 n处理同一克隆米A23187（A），thapsigargin（Thap；10μ米)或staurosporine（Sta；80 n米). 在这些实验中，根据Student’st吨测验。在所有这些研究中，数据显示了至少两个不同实验的平均值和标准差，实验分为三次进行。
图7。
图7。
Grp58与PrP相互作用，但不改变其成熟过程。A类、未经处理的N2a细胞（NT）、感染RML羊痒朊病毒或用5μ米用抗PrP单克隆抗体6H4裂解环氧霉素并免疫沉淀（IP）。Western blot分析Grp58和Grp78的水平。作为对照，在PrP免疫沉淀前分析总提取物中这些蛋白的水平。B类在转染Grp58siRNA、模拟siRNA或全长Grp58（Grp58 OE）的N2a克隆中瞬时表达Prp-GFP融合蛋白，并分析GFP荧光分布。C类，用50μ米brefeldin A（Bref.A）或不治疗，分析PrP分布（绿色荧光）。作为细胞内标记物，对染色的calnexin进行分析（红色荧光）。细胞核用Hoechst（蓝色荧光）染色。显示了GFP和calnexin的叠加或calnexin和Hoechst染色。D类小鼠PrP过表达，细胞提取物用PGNase F处理或不处理，PrP模式用Western blot分析。作为阳性对照，用5μg/ml衣霉素（Tunic）处理野生型细胞12小时，二糖基化；M、 单糖基化；N、 非糖基化的。
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