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比较研究
.2005年3月9日；25(10):2566-75.
doi:10.1523/JNEUROSCI.4998-04.2005。

β-淀粉样蛋白刺激的小胶质细胞通过协同刺激肿瘤坏死因子-α和NMDA受体诱导神经元死亡

安吉拉·弗洛登 1, 李珊珊, 科林·K·库姆斯
附属公司
比较研究

β-淀粉样蛋白刺激的小胶质细胞通过协同刺激肿瘤坏死因子-α和NMDA受体诱导神经元死亡

安吉拉·弗洛登等。 神经科学. .

摘要

虽然在阿尔茨海默病（AD）大脑中发现大量反应性小胶质细胞与β-淀粉样蛋白（Abeta）斑块相关，但它们对细胞丢失的贡献仍然是推测性的。各种研究已经证明阿贝塔原纤维在体外直接刺激小胶质细胞的能力，使其呈现出以分泌过多促炎分子为特征的神经毒性表型。总之，这些数据表明，活化的小胶质细胞在AD的神经元死亡中起着直接作用，而不仅仅是在斑块沉积后的清除中起作用。虽然很明显，阿贝塔刺激的小胶质细胞会急性分泌有毒氧化物质，但长寿命神经毒剂的身份仍不太明确。我们使用来自原代小鼠小胶质细胞的阿贝塔刺激条件培养基来鉴定更稳定的神经毒性分泌物。NMDA受体拮抗剂美金刚胺和2-氨基-5-磷酸以及可溶性肿瘤坏死因子-α（TNFalpha）受体保护神经元免受小胶质细胞条件性介质依赖性死亡，兴奋性神经递质谷氨酸和促炎细胞因子TNFalpha是小胶质细胞刺激死亡的效应器。神经元死亡以氧化损伤依赖的方式发生，需要诱导型一氧化氮合酶的活性。同时刺激TNFalpha和NMDA受体会产生毒性，因为单独刺激两者都不足以引发细胞死亡。这些发现表明，AD大脑为TNFalpha和谷氨酸提供适当的小胶质细胞介导的炎症环境，协同刺激神经元中各自信号通路的毒性激活，作为细胞死亡的一种机制。

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数字

图1。
图1。
来自Aβ刺激的小胶质细胞的条件培养基以TNFα依赖的方式诱导神经元死亡。来自原代小鼠小胶质细胞的条件神经基础培养基（CM）（400个细胞/mm2)使用或不使用（对照）固定化Aβ1-42纤维（48 pmol/mm）刺激48小时2)已生成。A类将对照组和Aβ刺激的条件培养基应用于小鼠皮层神经元培养（E16；7 d在体外)将神经元固定在4%多聚甲醛中72 h，用抗MAP2抗体染色并计数。来自四个场/条件的神经元在四个孔中计数，并平均±SEM。该图代表三个独立实验。B类收集条件培养基，并通过商业ELISA测定TNFα浓度。该图代表了三个独立的实验。C类在没有或存在可溶性TNFRI（0.1μg/ml）的情况下，用未刺激和Aβ刺激的条件培养基培养皮层神经元72 h。神经元固定，用抗MAP2抗体染色，如上所述计数，平均±SEM。该图代表三个独立实验。D类，含有固定化Aβ浓度增加的平板培养基（0、48、96和192 pmol Aβ1-42/mm2)单独转移至皮层神经元72小时，固定并计数神经元，如上所述确定统计显著性。*第页对照组<0.001；**第页<0.001来自CM。
图2。
图2。
条件性介质依赖性死亡需要NMDA受体活性。A类，来自原代小鼠小胶质细胞（400个细胞/mm）的条件性神经基底细胞培养基（CM）2)使用或不使用（对照）固定化Aβ1-42纤维（48 pmol/mm）刺激48小时2)并从培养基中计算出微摩尔谷氨酸浓度。该图是三个独立实验的平均±SEM。皮层神经元（E16；7 d在体外)用来自原代小鼠小胶质细胞的条件培养液培养72 h，这些小胶质细胞在缺乏或存在1μ米美金刚和10μ米无人机(B类)或1、5和50μ米国家银行QX(C类). 然后固定神经元，用抗MAP2抗体染色并计数。来自四个场/条件的神经元在四个孔中计数，并平均±SEM。图代表三个独立实验。*第页对照组<0.001；**第页与CM相比<0.001。
图3。
图3。
TNFα和谷氨酸/NMDA协同刺激神经元死亡。小鼠皮层神经元（E16；7 d在体外)在没有或存在NMDA（50，100μ米)(A类)，谷氨酸盐（25、50、100μ米)(B类)和小鼠TNFα（5，50 ng/ml）。将刺激物加入神经元72 h，然后固定细胞，用抗MAP2抗体染色并计数。来自四个场/条件的神经元在四个孔中计数，并平均±SEM。图代表三个独立实验。*第页对照组<0.05；**第页对照组<0.001。
图4。
图4。
条件培养基和TNFα加NMDA依赖性神经元死亡具有相似的时间过程。小鼠皮层神经元（E16；7 d在体外)在没有或存在来自小胶质细胞的条件培养基的情况下培养，这些小胶质细胞48小时未受Aβ1-42纤维、NMDA（100μ米)和小鼠TNFα（50 ng/ml）。A类将刺激物添加到神经元中，持续0-72小时。在选定的时间点，对细胞进行固定、染色和计数。B类或者，将刺激物添加到神经元上1 h，然后用新鲜培养基替换，总时间为72 h后固定。四个场/条件下的神经元在四个孔中计数，并平均±SEM。图代表三个独立实验。*第页对照组<0.001。
图5。
图5。
条件培养基和TNFα加NMDA依赖性神经元死亡均涉及iNOS活性和过氧亚硝酸盐的形成。小鼠皮层神经元（E16；7 d在体外)在无条件培养基或有条件培养基的情况下培养小鼠原代小胶质细胞，48小时后用Aβ1-42纤维、NMDA（100μ米)和小鼠TNFα（50 ng/ml）。A类，在100μ米MnTBAP或10μ米1400W.2盐酸。B类在100μ米MnTBAP或10μ米1400W.2盐酸。刺激神经元72小时，然后固定、染色并计数。来自四个场/条件的神经元在四个孔中计数，并平均±SEM。图代表三个独立实验。*第页对照组<0.001；**第页<0.001来自CM。
图6。
图6。
TNFα加NMDA依赖性神经元死亡刺激iNOS蛋白水平和活性增加。用TNFα（50 ng/ml）、100μ米NMDA或TNFα加NMDA。A类为了测定iNOS蛋白水平，对神经元进行裂解，并用10%SDS-PAGE和兔抗iNOS抗体进行蛋白质印迹。通过增强化学发光观察抗体结合。用识别神经元特异性βIII微管蛋白的抗体对裂解液进行印迹，作为蛋白质负荷对照。印迹是四个独立实验的代表。B类为了评估一氧化氮合酶，在用TNFα、NMDA或TNFα加NMDA刺激72小时后，定量神经介质中亚硝酸盐和硝酸盐的活性浓度。将亚硝酸盐/硝酸盐浓度标准化为细胞数，并从三个独立实验的每个条件下的六次重复中求出平均值(*第页与各自的对照组相比<0.001）。C类用10%SDS-PAGE分离三份AD和三份对照脑中颞叶回匀浆的蛋白质，并用兔抗iNOS抗体进行Western blot。通过增强化学发光观察抗体结合。用识别神经元特异性βIII微管蛋白的抗体对裂解液进行印迹，作为蛋白质负荷对照。
图7。
图7。
TNFα加NMDA依赖性神经元死亡刺激蛋白硝基酪氨酸水平增加。用TNFα（50 ng/ml）、100μ米NMDA、TNFα+NMDA或1和5μ米SIN-1。A类为了测定硝基酪氨酸蛋白水平，对神经元进行裂解，并用10%SDS-PAGE对蛋白质进行免疫沉淀和解析，并用小鼠抗硝基酪氨酸抗体进行蛋白质印迹。通过增强化学发光观察抗体结合。印迹是四个独立实验的代表。B类为了评估SIN-1依赖性蛋白，对硝化细胞进行裂解，对硝化蛋白进行免疫沉淀，用10%SDS-PAGE进行解析，并用抗硝基酪氨酸抗体进行印迹。C类从三个AD和三个对照脑样品的中颞叶脑匀浆中免疫沉淀含硝基酪氨酸的蛋白质，并用10%SDS-PAGE和抗硝基酪氨酸抗体的Western blot进行分离。通过增强化学发光观察抗体结合。免疫球蛋白G重链在斑点上识别（箭头），仅用于定位。
图8。
图8。
TNFα加NMDA诱导神经元iNOS免疫反应增强。神经元未受刺激(A类-D类)或受到刺激(E类-H（H）)72小时，TNFα（50 ng/ml）加100μ米NMDA，然后固定在4%多聚甲醛中。分别使用抗MAP2和抗iNOS抗体与FITC和德克萨斯红缀合的二级抗体对培养物进行双重标记。培养物安装在含有共焦成像安装介质的DAPI中。A类,E类，抗-MAP2；B类,F类，抗iNOS；C类,G公司，DAPI；D类，合并A类-C类;H（H），合并E类-G公司图像代表三个独立的实验。
图9。
图9。
神经元NMDAR亚单位免疫反应与TNFRI和TNFRII共定位。E16小鼠皮层神经元培养7天在体外然后收集到RIPA缓冲区中。A类，裂解产物通过10%SDS-PAGE进行解析，并使用识别NMDAR1、TNFRI和TNFRII的抗体进行蛋白质印迹。通过增强化学发光观察抗体结合。B类，神经元在第7天固定在体外并使用抗TNFRI/TNFRII和抗NMDAR1抗体进行双重免疫染色。分别使用针对TNFRI和TNFRII的Texas Red-conjugated anti-rabbit和FITC-conjuga anti-goat抗体，以及针对NMDAR1的Vector VIP，观察一级抗体结合。箭头显示了每个抗原的不同免疫反应水平。
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参考文献

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