Nuclear factor-kappaB1 (p50) limits the inflammatory and fibrogenic responses to chronic injury

doi:10.1016/s0002-9440(10)62291-2

.2005年3月；166(3):695-708.

doi:10.1016/s0002-9440（10）62291-2。

核因子-kappaB1（p50）限制慢性损伤的炎症和纤维生成反应

菲奥娜·奥克利¹, 杰勒娜·曼, 莎拉·奈拉德, 大卫·E·斯马特, 纳伦德拉·蒙加尔辛格, 克里斯托西娅·康斯坦迪努, 夏基尔·阿里, 苏珊·J·威尔逊, 哈里·米尔沃德·萨德勒, 约翰·P·伊雷代尔, 德里克·阿曼

附属公司

PMID： 15743782
PMCID公司：项目经理1602348
内政部： 10.1016/s0002-9440（10）62291-2

核因子-kappaB1（p50）限制慢性损伤的炎症和纤维生成反应

菲奥娜·奥克利等。美国病理学杂志. 2005年3月.

.2005年3月；166(3):695-708.

doi:10.1016/s0002-9440（10）62291-2。

作者

附属

¹英国南安普顿SO16 6YD南安普顿综合医院肝脏组。

PMID： 15743782
PMCID公司：项目经理1602348
内政部： 10.1016/s0002-9440（10）62291-2

摘要

在本研究中，我们通过在模拟慢性肝病的实验模型中测定nfkappab1-null小鼠的炎症和纤维化反应，探讨了核因子（NF）-kappaB1/p50亚单位在肝脏慢性损伤中的作用。通过腹腔注射四氯化碳肝毒素，小鼠在12周内反复受到肝损伤。作为回应，与nfkappab1（+/+）小鼠相比，nfkappab 1（-/-）小鼠出现了更严重的中性粒细胞炎症和纤维化。该表型与肿瘤坏死因子（TNF）-α的肝脏表达升高有关，肿瘤坏死因子-α定位于与炎症和纤维化相关的肝脏区域。肝星状细胞是肝脏炎症和纤维化事件的重要调节器，但通常不表达TNF-α。来自nfkappab1（-/-）小鼠的肝星状细胞表达TNF-α启动子活性、mRNA和蛋白质。相比之下，其他NF-kappaB应答基因（ICAM1和白介素-6）在nfkappab1（-/-）和nfkappa1（+/+）细胞中的表达相似。我们提供了实验证据，证明nfkappab1（-/-）细胞不恰当地表达TNF-α是因为缺乏p50依赖的组蛋白脱乙酰酶1（HDAC1）介导的TNF-阿尔法基因转录抑制。总之，这些数据表明，p50-NF-κB亚基通过限制TNF-α的表达及其对炎症细胞的募集，在受损的肝脏中发挥着关键的保护作用。

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数字

图1
稳定炎症变化*核因子κb1*^−/−肝脏。12周龄和1岁儿童肝脏切片的H&E染色*核因子κb1*^+/+和*核因子κb1*^−/−小鼠（编号是指精确的动物，肝脏切片来源于表1）。**黑色箭头**表示*核因子κb1*^−/−肝脏。显微照片代表五种*核因子κb1*^+/+和四个12周大或五个1岁的孩子*核因子κb1*^−/−老鼠。原始放大倍数，×200。

图2
损伤和恢复期间肝脏p50、RelB和p52的表达。p50、RelB和p52转录物的RT-PCR使用从*核因子κb1*^+/+和*核因子κb1*^−/−四氯化碳损伤或橄榄油（sham）12周后恢复第1、5和7天的肝脏。所示凝胶至少是来自三只动物/治疗组/基因型的两个实验重复。在PCR产物旁边放置一个1-kb的DNA阶梯（未显示），以确认扩增cDNA片段的正确大小。

图3
慢性损伤患者的严重炎症*核因子κb1*^−/−肝脏。答：健康与环境(**左上角**和**正确的**,**黄色箭头**表示膨胀的肝细胞）和中性粒细胞免疫染色(**左下角**和**正确的**,**红色箭头**表示中性粒细胞）染色*核因子κb1*^+/+和*核因子κb1*^−/−CCl 12周后恢复第1天的肝脏切片₄受伤。显微照片代表五种*核因子κb1*^+/+和四个*核因子κb1*^−/−老鼠。**B类：**计算15个高倍视野中的中性粒细胞数量，并用中性粒细胞平均数/高倍视野±SEM表示。第1天，*P（P）*= 0.0016; 第3天，*P（P）*= 0.0185; 第5天，不显著；第7天，*P（P）*= 0.0039; 第14天，*P（P）*= 0.0117;*P（P）*使用成对计算的值吨-测试。原始放大倍数，×100。

图4
肝纤维化在*核因子κb1*^−/−老鼠。答：CCl 12周后恢复第1天和第7天肝切片的天狼星红染色₄受伤。**黑色箭头**表示胶原蛋白纤维，代表五种*核因子κb1*^+/+和四个*核因子κb1*^−/−老鼠。**B类：**以平均等级±SEM表示的纤维化评分*核因子κb1*^+/+和四个*核因子κb1*^−/−小鼠在恢复第1天和第7天。**抄送：**CCl 12周后第1、3、5、7和14天从全肝提取物中测量的20 ng cDNA中I型前胶原mRNA的TaqMan分析₄受伤。计算转录差异的相对水平，并将其表示为四个样本的平均±SEM核因子κb1^−/−和五个*核因子κb1*^+/+动物。平均周期数为：第1天、24.60天和27.21天；第3天，25.63和27.32；第5天、第26.33天和第27.10天；第7天、27.0天和27.87天；第14天、第31.87天和第29.88天*核因子κb1*^−/−和*核因子κb1*^+/+分别是。差异具有统计学意义，*P（P）*=0.0329，并使用配对吨-测试。**医生：**20 ng全肝提取物cDNA中TIMP1 mRNA的TaqMan分析。计算转录差异的相对水平，并将其表示为四个样本的平均±SEM核因子κb1^−/−和五个*核因子κb1*^+/+动物。平均周期数为：第1天，31.42和33.47；第3天，34.09和35.15；第5天、第34.19天和第35.14天；第7天、第34.27天和第34.23天；第14天、第36.68天和第36.09天*核因子κb1*^−/−和*核因子κb1*^+/+分别是。差异具有统计学意义，*P（P）*=0.0302，并使用配对吨-测试。原始放大倍数，×100。

图5
创伤愈合肝肌成纤维细胞数量增加*核因子κb1*^−/−肝脏。答：伤后第1天和第7天肝脏α-SMA免疫染色。显微照片代表了四种*核因子κb1*^−/−和五个*核因子κb1*^+/+每个时间点的老鼠。**B类：**对15个高倍视野中的α-SMA阳性细胞数进行计数，并用四个高倍磁场中α-SMA阴性细胞/高倍视野±SEM的平均数表示*核因子κb1*^−/−和五个*核因子κb1*^+/+每个时间点的动物。第1天，*P（P）*= 0.0017; 第3天，*P（P）*= 0.035; 第7天，*P（P）*= 0.048; 第14天不显著；*P（P）*使用成对计算的值吨-测试。**抄送：**恢复第1、3、5、7和14天，在20 ng全肝cDNA中测量的α-SMA mRNA的TaqMan定量。转录差异的相对水平用四个样本的平均±SEM表示*核因子κb1*^−/−和五个*核因子κb1*^+/+每个时间点的动物数。平均周期数为：第1天，32.42和33.57；第3天，33.66和35.16；第7天、第35.29天和第36.69天；第14天、35.62天和37.08天*核因子κb1*^−/−和*核因子κb1*^+/+分别是。然而，未发现差异具有统计学意义，*P（P）*=0.16，使用配对吨-测试。原始放大倍数，×200。

图6
激活标记之间缺乏差异*核因子κb1*^−/−和*核因子κb1*^+/+HSC。答：从培养激活的HSC中分离出全细胞提取物，并使用25μg进行α-SMA、结蛋白、p75、胶质纤维酸性蛋白（GFAP）和β-肌动蛋白的免疫印迹。所有凝胶均代表至少两个独立实验。**B类：**TaqMan分析20 ng活化HSC cDNA中测得的I型前胶原mRNA。计算转录差异的相对水平，并将其表示为三种独立细胞制剂的平均±SEM。胶原蛋白的平均循环数为18.45和20.55，18s RNA的平均循环次数为18.68和20.45核因子κb1^−/−和*核因子κb1*^+/+分别是。成对使用吨-测试显示差异不显著(*P（P）*= 0.4).

图7
TNF-α的选择性过度表达*核因子κb1*^−/−HSC。答：三个*核因子κb1*^−/−和三个*核因子κb1*^+/+小鼠被用来产生六个独立的活化HSC系(^−/−1至3和^+/+1至3）。从所有六个株系中分离出总RNA，并将其用作RT-PCR反应的模板，使用材料和方法中描述的方案检测ICAM-1、IL-6、TNF-α和β-actin转录物。所示凝胶呈现为三组基因型对，代表每个RNA样本的两个重复RT-PCR。在PCR产物旁边放置一个1-kb的DNA阶梯，以确认扩增cDNA片段的正确大小（未显示）。**B类：**从中分离出全细胞提取物*核因子κB*1^−/−-和*核因子κb1*^+/+-用活化HSC和夹心ELISA定量TNF-α水平，即TNF-β/μg全细胞提取物的平均ng±SEM，n个= 3核因子κb1^−/−和*核因子κb1*^+/+-独立隔离。

图8
慢性损伤患者TNF-α升高*核因子κb1*^−/−肝脏。答：从三只猪的肝脏中分离出总RNA核因子κb1^−/−和三个*核因子κb1*^+/+在损伤后12周的第1天，将小鼠作为模板用于TNF-α和β-肌动蛋白转录物的RT-PCR反应。凝胶显示了三个肝脏/基因型的RT-PCR产物，并且代表了每个RNA样品的两个重复RT-PCR。**B类：**在损伤后第1天提取全肝蛋白提取物，并用夹心ELISA法定量TNF-，n个= 4核因子κb1^−/−和5核因子κb1^+/+).抄送：伤后第1天肝切片TNF-α免疫染色，箭头表示TNF-α表达细胞主要定位于炎症浸润周围区域*核因子κb1*^−/−肝脏。显微照片代表了四种*核因子κb1*^−/−和五个*核因子κb1*^+/+动物。**医生：**TNF-α和α-SMA双重免疫染色*核因子κb1*^−/−伤后第1天的肝脏切片，**黄色箭头**表示TNF-α和α-SMA共定位。原始放大倍数：×100(C类,顶部); ×200 (C类,底部); ×1000 (D类).

图9
TNF-α启动子活性在*核因子κb1*^−/−HSC。答：激活的HSC与*核因子κb1*^−/−和*核因子κb1*^+/+用10 ng pRLTK（Renilla对照）和1μg pTNF-α-Luc转染小鼠。48小时后，测定荧光素酶活性，并将其归一化为pRLTK核因子κb1^−/−表达为启动子活性的细胞相对于*核因子κb1*^+/+细胞（三次转染的平均值±SE）**B类：**用10 ng pRLTK、1μg pTNF-α-Luc和2μg pCDNA转染HSC_三-p50（+p50）或pCDNA_三(−). 48小时后，测定荧光素酶活性，将其归一化为pRLTK活性，并表示为与pCDNA中测得的活性相关的启动子活性_三-转染细胞（三次转染的平均值±SE）。

**图10**
HDAC1介导的TNF-α转录抑制是p50依赖性的。A类(顶部):在使用或不使用500 nmol/L TSA治疗24小时之前，用10 ng pRLTK和1μg pTNF-α-Luc转染活化的HSC 24小时。测定荧光素酶活性，将其归一化为pRLTK活性，并表示为与缺乏TSA处理的细胞中测得的活性相关的启动子活性。A类(底部):同上，但包含pCDNA_三p50在转染混合物中。所有转染均一式三份。B类(顶部):总RNA从*核因子κb1*^−/−和*核因子κb1*^+/+HSC并用作HDAC1 RT-PCR检测的模板。B类(底部):从*核因子κb1*^−/−-和*核因子κb1*^+/+-活化的HSC和25μg蛋白质用于HDAC1和β-肌动蛋白的免疫印迹。**抄送：**用10 ng pRLTK和0.5μg pTNF-α-Luc单独（−）或与1μg pCDNA一起转染活化的HSC_三和2μg pHDAC1（HDAC1）或1μg pCDNA_三-p50和2μg pHDAC1（p50+HDAC1）。48小时后，测定荧光素酶活性，将其归一化为pRLTK活性，并表示为与单独转染pTNF-α-Luc的细胞活性相关的启动子活性（三次转染的平均值±SE）。

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