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.2005年3月1日；19(5):603-13.
doi:10.1101/gad.1273605。

FGF8启动鸡和小鼠内耳诱导

拉杰·拉德尔 1, 特蕾西·赖特, 安妮·穆恩, 苏珊·曼苏尔, 加里·斯科恩沃尔夫
附属公司

FGF8启动鸡和小鼠内耳诱导

拉杰·K·拉多尔等。 基因开发. .

摘要

在小鸡和小鼠中，内耳的原基耳板由至少两个信号诱导，一个来自头旁中胚层，另一个来自神经外胚层。在小鸡中，中胚层信号FGF19诱导神经外胚层表达额外信号，包括WNT8c和FGF3，导致耳板的诱导。在小鼠中，中胚层Fgf10与神经Fgf3冗余作用是诱导placode所必需的。为了确定耳板的中胚层诱导物是如何定位的，我们利用了两种模式生物的独特优势。我们证明，内胚层对小鸡的耳诱导是必要的，Fgf8在Fgf19下的小鸡内胚层中表达，对于Fgf19在中胚层中的表达是充分和必要的。在小鼠中，Fgf8也在内胚层以及耳周板区的其他胚层中表达。我们的研究表明，Fgf3基因为零、Fgf8基因为低形态的胚胎的耳诱导失败，中胚层Fgf10的表达降低。因此，Fgf8在鸡和小鼠耳诱导所需的FGF信号级联中发挥关键的上游作用。

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图1。
图1。
内胚层消融阻碍耳发育。从培养24-36小时的鸡胚中单方面去除内胚层，帕克斯2.(A类)内胚层切除示意图（方框）。(B类)背视图显示较小的耳域帕克斯2在操作的(左边)侧面。黑线表示截面的轴向水平C类. (C类)显示较小左耳板的截面（箭头所示）。
图2。
图2。
中胚层第19层表达需要下胚层。单独培养或与第4期鹌鹑内胚层一起培养第5期离体鸡喙部中胚层。当阶段匹配的全胚胎对照达到第8阶段时，将外植体固定，然后与小鸡特异性杂交第19层探查。(A类)方框输入左边图示为中胚层移植。中的框正确的图示为内胚层移植。(B类)去除外胚层和内胚层的中胚层外植体仅显示背景标记。(C类)当与尾侧内胚层重组时，中胚层外植体表达第19层（装箱）。(D类)罗斯特拉内胚层未能诱导第19层.
图3。
图3。
小鸡Fgf8型表达于中胚层下的内胚层第19层用所示探针进行原位杂交处理的鸡胚胎。中的行A类和C类指示中所示部分的级别B类和D类分别是。(A类)6期（无晶体）胚胎的背视图显示了两个表达域Fgf8型颅内胚层：发育中的心脏雏形（h）下方的马蹄形区域和原始条纹（ps）的嘴侧横区。(B类)显示的部分Fgf8型横向内胚层域表达（箭头所示）。(C类)6期胚胎背视图第19层在原始条纹（ps）和轴旁中胚层两侧斑块中的表达Fgf8型横向内胚层结构域。(D类)显示双边的部分第19层在近轴中胚层的表达（箭头）。(E类)8期（三体节）胚胎背视图Fgf8型在原始条纹（ps）、颅骨内胚层结构域和心脏原基下的内胚层（h）中表达。注意内胚层表达的横条纹（箭头）正好位于第一对体节的吻侧。(F类)8期胚胎背视图第19层在原始条纹（ps）和双侧近轴中胚层斑块（箭头）中的表达正好位于第一对体节的吻侧。
图4。
图4。
FGF8足以第19层表达式。分离或在FGF4或FGF8存在下培养剥离的5期鸡中胚层。(A类)未经处理的中胚层外植体无法表达第19层培养8h后。(B类)用FGF4珠处理的中胚层外植体也不表达第19页。(C类)FGF8珠处理的中胚层外植体表达第19层（箭头）。
图5。
图5。
FGF8对于第19层表达和内耳诱导。两种质粒，组蛋白-2B/Venus融合构建物和沉默剂-Fgf8型，在第4阶段鸡胚的一侧进行共电穿孔。将处理后的胚胎培养4-8或24-36小时，用荧光灯进行观察，然后用所示的探针进行原位杂交。(A类)金星荧光（黄色）表示电穿孔区域。(B类)Fgf8型转录物在Venus表达区下调（箭头）。(C-E公司)在第7阶段，电穿孔后4-8小时，用pSilencer处理胚胎-Fgf8型矢量显示横向减少第19层表达式。(C类)只分析了具有适当靶向金星荧光（黄色）的胚胎。(D类)整个底座显示横向损失第19层电穿孔蛋白的表达(左边)侧面。箭头在D类和E类在两个正确的和左边边。直线标记中截面的标高E类.(E类)显示损失的部分第19层电穿孔细胞在外侧近轴中胚层的表达(左边)侧面。(F-H（飞行高度）)在第12-14阶段（电穿孔后24-36小时），用pSilencer处理胚胎-Fgf8型矢量显示损失帕克斯2电穿孔膜上血小板形态的表达和形成失败(左边)侧面。(F类)只分析了具有适当靶向金星荧光（黄色）的胚胎。(G公司)整个底座显示损失帕克斯2电穿孔侧的表达。直线标记中截面的标高H（H）.(H（H）)显示损失的部分帕克斯2电穿孔蛋白的表达(左边)侧面。此外，与正常人相比，明显的是，血小板形态无法形成（箭头所示）帕克斯2-在上表达placode正确的侧面。(我)救援实验中使用的三层外植体（盒装）的位置。(J型)对照外植体表达帕克斯2. (K（K）)Fgf8型siRNA电穿孔外植体不能表达帕克斯2.(L（左）)用FGF19珠（星号）express处理的电镀外植体帕克斯2（箭头）。
图6。
图6。
鼠标Fgf8型在与早期耳发育相关的组织中表达。(A、 C、F、I、M)E7.0-E8.0小鼠胚胎与Fgf8型在横向平面上进行探测和切片。(B、 D、G、J、N)耳部的剖面图（平面由穿过每个胚胎的线表示）显示在正确的每个完整胚胎。整体安装图像显示在背面(A、 C、I)或横向(F、 M（M）)视图。前部是指正确的. (E、 H、K)小鼠胚胎携带Fgf8型GFPR公司切割等位基因，用针对GFP（绿色）的免疫组织化学方法检测FGF8/GFP融合蛋白。(L（左）)PAX2免疫组织化学（红色）在与K（K）. (A、 B)在E7，Fgf8型在心脏中胚层（m）和原始条纹（ps）中表达。(C、 D类)Fgf8型内脏中胚层（m）和原始条纹（ps）的零体节表达。(E类)在三体节期，FGF8/GFP融合蛋白定位于内脏中胚层。(F-K公司)在四至六个体位时，Fgf8型转录物和FGF8/GFP融合蛋白在整个表面外胚层表达，包括预期板层（pp）、咽内胚层（e）、内脏层以及更多的背侧、近轴、中胚层（m）和原始条纹（ps）。在这些阶段，Fgf8型也表达于咽内胚层（e）和内脏，以及更多的背部、近轴、中胚层（m）和原始条纹（ps）。(L（左）)在6个体节胚胎中，PAX2在预期板（pp）外胚层的表达与FGF8/GFP融合蛋白在外胚层中的表达共定位K（K）. (M、 N个)通过八个体节，Fgf8型表面外胚层的表达被排除在背耳板（pp）之外，但在腹外胚层中保持不变。咽内胚层（e）的表达保持不变。在端脑（t）中还检测到表达。后脑神经外胚层（n）缺乏表达。
图7。
图7。
耳道发育受阻，但后脑发育受阻Fgf3/Fgf8双突变胚胎。(A、 C、E、G、I、K、M、O、Q、S、U、W)对E8.5-9.5对照和突变胚胎进行处理，以使用指示给左边每行的。胚胎在冠状面或冠状面切片(B、 D、F、H、R、T、V、X)或横向平面(J、 L、N、P). 穿过耳区的截面（平面由穿过每个胚胎的线表示）显示在正确的每个完整胚胎。整体安装图像显示在侧视图中，从嘴到正确的.每个胚胎的基因型指示给右下角每个整体安装面板。(A-H公司)公式9.5Fgf3/Fgf8双突变体，但不是Fgf3型-/-或Fgf8型H（H）/-突变体，不能形成耳泡（ov）或表达帕克斯2在耳区。这个氪该实验中的探针也未能成功标记对照后脑(A、 B)，所以它在Fgf3型突变体(E、 F类)无法解释。然而氪探针确实标记了Fgf8型突变体(C、 D类)和双突变体(G、 小时)后脑，表明r5和r6在这些胚胎中是正常的。(I-L公司)在E8.5对照胚胎中，帕克斯2表达于耳板（op）和腹表面外胚层（se）。在Fgf3/Fgf8双突变体，帕克斯2在背表面外胚层失去表达（用括号表示）。霍克斯b1r4中的表达在Fgf3/Fgf8双突变体。(M-P型)在E8.5处，帕克8表达贯穿于对照胚胎的耳板（op）和腹表面外胚层（se）。在Fgf3/Fgf8双突变体，帕克8在背表面外胚层失去表达（用括号表示）。(Q-T（质量-温度）)克罗克斯20r3和r5的表达在Fgf3/Fgf8双突变体。(U-X型)氪r6和r5的表达在Fgf3/Fgf8双突变体。（pn）Pro-nephros；（i） 地峡；（e） 眼睛；（n） 神经外胚层。
图8。
图8。
如果没有Fgf3型，耳发育对Fgf8型和Fgf10型.E9.5胚胎从Fgf3型和Fgf8型等位基因或Fgf3型和Fgf10型对等位基因进行处理，以进行原位杂交Gbx2在横向平面上进行探测和切片。穿过耳区的剖面图（平面由穿过每个胚胎的线表示）显示在正确的每个完整胚胎。全贴装图像标记有基因型和体节（som）数量，并在侧视图中显示，从吻侧到正确的. (A-L公司)在控制中，Fgf3型+/+;Fgf8型H（H）/-、和Fgf3型+/-;Fgf8型H（H）/-胚胎，Gbx2在耳囊背内侧正常表达。在Fgf3型-/-;Fgf8型+/+和Fgf3型-/-;Fgf8型+/-胚胎，Gbx2表达分别减弱和缺失。在Fgf3/Fgf8双突变体，无耳囊和无耳囊Gbx2检测到表达式。(M-X公司)在控制中，Fgf3型+/+;Fgf10型-/-、和Fgf3型+/-;Fgf10型-/-胚胎Gbx2正常表达于耳杯（oc）的背内侧区。在Fgf3型-/-;Fgf10型+/+胚胎的水平Gbx2在一个耳杯中表达减少，说明该表型的可变表达率。在Fgf3型-/-;Fgf10型+/-和Fgf3/Fgf10双突变胚胎Gbx2耳区无表达。在Fgf3/Fgf8双突变体(K（K）)，缺少Gbx2表达与可识别的耳组织完全消失一致。然而，一些组织紊乱的外胚层组织（缺乏Gbx2表达式）显示在Fgf3型-/-;Fgf10型-/-胚胎（箭头）。（n） 神经外胚层。
图9。
图9。
中胚层的表达Fgf10型减少了Fgf3/Fgf8双突变体。腭前控制(A、 C、E)和Fgf3/Fgf8双突变体(B、 D、F)小鼠胚胎与Fgf10型或Gbx2如每块面板所示，并在横向平面上剖切。(A、 B)通过零体节胚胎耳区的切片显示Fgf10型内侧中胚层的表达（用括号表示）。(C、 D类)通过八个体节胚胎的耳部区域进行的切片显示Fgf10型在背外胚层下的间充质中表达，耳板预计在此处形成(E、 F类)通过零粒胚胎耳区的切片显示，中胚叶Gbx2表达不受影响Fgf3/Fgf8双突变胚胎。
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