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.2005年2月17日；6(1):8.
doi:10.1186/1471-212-6-8。

纤维连接蛋白和玻璃体凝集素上新的肝细胞生长因子（HGF）结合域协调内皮细胞中不同且扩增的Met-整合素诱导的信号通路

萨尔曼·拉赫曼 1, 亚丁·帕特尔, 杰奎琳·默里, 柯蒂·五·帕特尔, 鲁西卡·苏马提帕拉, 索布尔, Error S Wijelath公司
附属公司

纤维连接蛋白和玻璃体凝集素上新的肝细胞生长因子（HGF）结合域协调内皮细胞中不同且扩增的Met-整合素诱导的信号通路

萨尔曼·拉赫曼等。 BMC细胞生物学. .

摘要

背景：成年生活中新生血管的生长除了需要循环内皮祖细胞的招募和分化外，还需要从已有血管开始内皮细胞迁移和增殖。生长因子和细胞外基质发出的信号在调节这些过程中很重要。

结果：在这里，我们报道了纤维连接蛋白（FN）和玻璃体凝集素（VN）调节内皮细胞对HGF（分散因子）的反应，HGF是一种重要的促血管生成介质。在FN和VN上都发现了新的HGF结合位点，它们产生具有增强生物活性的分子复合物，并且在脱颗粒血小板悬浮液的上清液中发现了这些结合位点，这意味着它们在体内的释放和形成。在没有与ECM糖蛋白共同刺激的情况下，HGF不能促进内皮细胞迁移，但保留了利用Map激酶途径诱导增殖反应的能力。通过促进Met-Integrin协会，HGF-FN和HGF-VN复合物通过激活涉及Ras依赖机制的PI-3激酶途径来协调和增强内皮细胞迁移，而Ras依赖和减弱的迁移反应则通过与HGF和非结合伙伴ECM糖蛋白（如胶原蛋白-1）共同刺激细胞来促进。

结论：这些研究确定了内皮细胞中HGF信号转导的新机制和途径，涉及Met和整合素之间以Ras依赖的方式合作。这些发现对健康和疾病中新生血管的调节都有意义。

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数字

图1
图1
FN和VN上HGF结合域的鉴定以及血小板上清液中HGF-FN和HGF-VN复合物的存在。面板A-涂有各种基质蛋白或BSA（10μg/ml）的塑料孔与125I标记的HGF达到平衡，然后清洗并在γ计数器中计数。面板B-塑料孔涂有FN和FN衍生的蛋白水解片段或BSA。125将I标记的HGF在这些孔中孵育至平衡结合，洗涤并使用γ计数器测定结合的HGF水平。面板C&D类-通过SPR实时将HGF与FN 70kDa片段结合。面板C-HGF浓度增加的实时结合等温线（0，16.5，31.25，62.5，125，188，250，315，375，500 nM），结合和解离阶段，用于单个代表性实验，箭头指示注射开始和结束。面板D-将面板C的数据绘制为HGF浓度（30–500 nM）的函数。插图显示了通过Scatchard方法分析的数据，显示了具有K的单个结合位点dapp公司=300毫微米。这些数据也同样适用于双站点模型（详见正文）。n=3。面板E-血小板悬液（20.0×108/ml）在室温下用生理盐水（-）或1 U/ml凝血酶（+）刺激5分钟，以允许脱颗粒。通过离心（100000×g）清除细胞和膜物质，用FN单克隆抗体或同型匹配的对照试剂（对照IgG）免疫沉淀上清液。免疫复合物通过SDS-PAGE和免疫印迹探针与HGF（Santa Cruz）抗体进行分析。将印迹剥离并用FN抗体进行再验证，以确认初级免疫沉淀步骤的特异性。面板F-从凝血酶刺激的血小板中提取的上清液用对FN、VN或同型匹配的对照试剂具有特异性的抗体进行免疫沉淀。如图E所示，对免疫复合物进行了分析。下表显示了相同的印迹剥离，并用VN单克隆抗体进行了重新免疫，以确认初步沉淀。通过化学发光显影印迹。所示数据是重复三次实验的典型斑点。
图2
图2
ECM分子对HGF诱导的内皮细胞迁移的影响。面板A-染色HMVEC悬浮液（9×104/在改良的Boyden小室试验中，在存在或不存在ECM分子、FN或VN或胶原蛋白-1的情况下，用HGF（10 ng/ml）处理。在3小时时测量细胞迁移。数据表示为相对迁移，迁移响应表示为在无刺激的情况下与基础迁移的比率。面板B-测定了细胞对涂有聚赖氨酸（PLL）或各种ECM糖蛋白的Fluorblok transwell过滤器的粘附水平。染色HMVEC（105细胞）用HGF（10 ng/ml）处理30分钟，然后将其应用于横孔的上腔。在广泛清洗后，使用荧光板阅读器测定粘附细胞的数量。整合素在HGF和FN刺激的细胞中介导迁移反应的作用和特性（C组）和HGF与VN（D组）通过用具有整合素α特异性的抗整合素单克隆试剂（10μg/ml）预处理HMVEC悬浮液来证明5β1（JBS5），αv（v）β三（LM609）和αv（v）β5（LM142）在室温下放置30分钟，然后将其应用于上横向套管室。数据以荧光单位表示为特定迁移反应，从总迁移反应中减去基本迁移反应。（n=2）。
图3
图3
Met与整合素的结合由HGF-FN和HGF-VN复合物驱动。面板A-HMVEC（1×106/ml）接种到胶原蛋白-1、FN或VN涂层塑料孔上，并在室温下用生理盐水或HGF（10 ng/ml）刺激60分钟。对细胞进行裂解，并用整合素α抗体对相应的裂解产物（500μg蛋白质）进行免疫沉淀2β1（车道1和4），αv（v）β三（车道2和5）和α5β1（3号和6号车道）。免疫复合物通过SDS-PAGE和Western blotting探针分析，抗Met抗体使用化学发光检测（顶面板）。底部面板显示了通过SDS-PAGE（40μg/lane）分析后相应细胞裂解液中Met的抗原水平，在实验期间，使用Met抗体进行的Western blotting探针基本上没有改变。面板B-HMVEC（5×106)在室温下的指定时间段用HGF或HGF-FN或HGF-VN复合物刺激。用磷酸酪氨酸Met多克隆抗体对细胞进行裂解和免疫沉淀，并使用Met单克隆抗体通过SDS-PAGE和Western blotting分析免疫复合物。用化学发光法检测Met抗原。面板C-HMVEC（5×106)在室温下用HGF或HGF-FN或HGF-VN复合物刺激15分钟。用整合素α单克隆抗体对细胞进行裂解并对裂解产物进行免疫沉淀5β1和αv（v）β三通过SDS-PAGE和Western blotting探针分析免疫复合物和Met多克隆抗体。
图4
图4
HGF-FN和HGF-VN复合物通过PI3激酶途径增加HMVEC迁移。面板A-HMVEC悬浮液（1×106/ml）在不存在ECM分子或存在胶原蛋白-1、FN或VN（2μg/ml）的情况下，在室温下用HGF（10 ng/ml）刺激不同的时间间隔（2–120分钟）。通过快速离心和细胞颗粒裂解停止反应。用SDS-PAGE和Western blotting探针分析细胞裂解物样品，并用对磷酸化Erk 1/2具有特异性的抗体进行分析（顶面板）。用Erk 2抗体（底部面板）重制印迹。面板B-A组的样品也用一种对磷酸化Akt（顶面板）具有特异性的抗体同时进行了检测，这些印迹被剥离并用Akt抗体重新进行了验证。通过化学发光进行可视化。面板C&D类-抑制剂对HMVEC迁移的影响，分别对应于HGF-FN和HGF-VN。该数据是一个使用三份样品的代表性实验，实验进行了三次，得出了基本相似的结果。
图5
图5
HGF诱导的HMVEC增殖需要Map激酶途径.面板A-将MCDB-131培养基中的HMVEC镀在密度为2.5×10的聚-D-赖氨酸涂层48-well板上三在存在或不存在ECM分子FN、VN或胶原蛋白-1的情况下，用HGF（10 ng/ml）刺激。用非补充培养基处理的细胞测量基底细胞增殖。使用CyQuant试剂在刺激后48小时对细胞数量进行量化。数据显示为HGF-FN和HGF-VN处理的样品与单独使用HGF处理的细胞相比，其增殖显著增加的细胞数，通过单向方差分析确定（p<0.05）n=3。面板B-HMVEC被镀到聚-D-赖氨酸涂层的微孔上（1×104/well）在补充培养基中过夜。然后用含有0.1%FBS和HGF（20 ng/ml）的培养基培养细胞，培养基中存在或不存在ECM蛋白（10μg/ml），如图所示，不含抑制剂（白色条）或MEK抑制剂U1026（10μM，黑色条）。使用CyQuant试剂在48小时后对细胞数量进行量化。
图6
图6
HGF-FN和HGF-VN复合物增强和持续激活Ras面板A-动力学GTP-Ras下拉分析。HMVEC悬浮液（3×106/如图所示，在无ECM分子（2μg/ml）和有ECM分子（10 ng/ml）的情况下，在室温下用HGF（10 ng/ml）刺激5、60和120分钟。车道静止。表示GTP-Ras的静止（非模拟）水平。细胞在冷MLB缓冲液中造粒并溶解（参见方法）。将无细胞裂解物样品与RBD-Sepharose孵育，然后通过SDS-PAGE和Western blotting探针分析Ras。使用柯达成像站通过化学发光进行可视化。面板B-通过使用ImageQuant软件（Kodak）进行密度分析，对面板A中显示的凝胶在60分钟时间点的GTP-Ras水平进行量化。
图7
图7
HGF-FN和HGF-VN诱导的HMVEC迁移依赖于Ras。面板A-GTP-Ras下拉分析显示FPT III（100μM）和GGTI（2μM）抑制剂对GTP-Ras水平的影响。HMVEC悬浮液（3×106/ml）在室温下用FPT III和GGTI抑制剂预处理45分钟，然后在室温下使用HGF-FN复合物刺激60分钟。样品分析如图2图例所示。面板B-Ras抑制对细胞迁移的影响。Calcein M负载HMVEC悬浮液（1×105/ml）在应用于transwell过滤器的顶部腔室之前，用上述抑制剂进行预处理。如图所示，用HGF加ECM蛋白刺激细胞（放置在底部室中）。在刺激后3小时使用荧光板阅读器测量细胞迁移。数据显示为相对迁移，是两个独立实验的组合数据，样本井一式三份。
图8
图8
HGF-FN诱导的Map激酶和PI-3激酶途径的激活是Ras依赖性的面板A&B类-HMVEC悬浮液用缓冲液（无抑制剂）或抑制剂FPT III（100μM）预处理，并在室温下控制GGTI（2μM）45分钟，然后在室温下用不含ECM蛋白的HGF或HGF+胶原蛋白-1或HGF-FN复合物刺激60分钟。细胞粒化并在冰镇裂解缓冲液中裂解。通过SDS-PAGE和Western blotting探针对样品进行磷酸化Erk 1/2（面板A）和磷酸化AKT（面板B）分析。通过图像分析软件测量的相对带强度被放置在每个带的上方，作为在不存在抑制剂的样品中获得的信号的比率。剥离印迹物，并用Erk 2和Akt抗体进行再验证，以确认载量相等。面板C-HMVEC悬浮液（5×106/ml）与FN或胶原蛋白在有或无HGF的情况下在室温下孵育60分钟。细胞在裂解缓冲液中成粒并裂解。用整合素α5β1和α2β1抗体对裂解产物进行免疫沉淀分析，用SDS-PAGE和免疫印迹探针对免疫复合物进行Ras抗体分析。通过化学发光进行可视化。
图9
图9
HGF诱导内皮细胞反应的机制。面板A-在没有ECM分子的情况下，HGF可以通过Met受体酪氨酸激酶激活Map激酶途径，从而导致增殖反应。面板B-HGF和与胶原蛋白的共同刺激通过一种未知机制诱导Map激酶和PI-3激酶途径的激活，可能是通过整合素连接实现的，这是Ras非依赖性的。面板C-HGF-FN（以及类似的HGF-VN）复合物通过促进整合素与Met受体的结合促进增强细胞反应，从而导致Ras、Erk 1/2激酶和PI-3激酶的招募和增强激活，从而促进增殖和迁移反应的增强。
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