The murine gammaherpesvirus 68 M2 gene is required for efficient reactivation from latently infected B cells

doi:10.1128/JVI.79.4.2261-2273.2005

.2005年2月；79(4):2261-73.

doi:10.128/JVI.79.4.2261-2273.2005。

小鼠γ-疱疹病毒68 M2基因需要从潜在感染的B细胞中有效地重新激活

杰里米·赫斯科维茨¹, 米根·A·雅各比, 塞缪尔·H·斯派克

附属公司

PMID： 15681428
预防性维修识别码：项目编号：546582
内政部： 10.1128/JVI.79.4.2261-2273.2005年

小鼠γ-疱疹病毒68 M2基因需要从潜在感染的B细胞中有效地重新激活

杰里米·赫斯科维茨等。 J维罗尔. 2005年2月.

.2005年2月；79(4):2261-73.

doi:10.1128/JVI.79.4.2261-2273.2005。

作者

杰里米·赫斯科维茨¹, 米根·A·雅各比, 塞缪尔·H·斯派克

隶属关系

¹美国佐治亚州亚特兰大埃默里大学医学院耶基斯国家灵长类动物研究中心新兴传染病中心，邮编30329。

PMID： 15681428
预防性维修识别码：第546582页
内政部： 10.1128/JVI.79.4.2261-2273.2005年

勘误表in

《维罗尔杂志》。2011年3月；85(6):3041. 赫斯科维茨，杰里米【更正为赫斯科维兹，杰里米·H】

摘要

小鼠γ-疱疹病毒68（gammaHV68）感染提供了一个易驾驭的小动物模型系统，用于评估建立和维持淋巴室中γ-疱疹潜伏期的要求。γHV68的M2基因产物是一种潜伏相关抗原，与任何已知的蛋白质没有明显的同源性。在这里，我们关注的是M2基因在脾脏B细胞潜伏期中的需求。我们的分析显示如下。（i）通过鼻内途径接种低剂量（100 PFU）导致在感染后第16天未能建立脾脏B细胞潜伏期。（ii）通过鼻内途径将接种剂量增加到4 x 10（5）PFU，部分恢复了第16天B细胞潜伏期的建立，但在组织培养中移植后未检测到病毒重新激活。（iii）尽管之前的数据未能在高剂量腹腔接种时检测到M2突变体的表型，但将腹腔接种剂量降至100 PFU后，第16天的脾脏B细胞潜伏期表型与高剂量鼻内接种时观察到的表型非常相似。（iv）低剂量腹腔接种后，分离的B细胞群显示M2突变病毒能够在表面免疫球蛋白D阴性（sIgD（-））B细胞中建立潜伏期；感染后6个月，检测到M2突变和标记物拯救病毒基因组阳性sIgD（-）B细胞的等效频率。（v）与标记物拯救病毒一样，M2突变病毒也在低剂量腹腔接种后在脾脏原始B细胞中建立潜伏期，但与标记物挽救病毒相比，这种潜伏感染的储存库的衰变有明显滞后。（vi）低剂量鼻腔接种后，在感染后第42天，在脾脏中观察到潜伏期，尽管其频率明显低于标记物拯救病毒感染小鼠；感染后3个月，在标记拯救病毒和M2突变病毒感染小鼠的脾脏中观察到几乎相等水平的病毒基因组阳性细胞，这些细胞仅为sIgD（-）B细胞。总之，这些数据令人信服地证明了M2基因产物在脾脏B细胞再激活中的作用，也表明M2基因的破坏会导致脾脏B细胞潜伏期有效建立中的剂量和途径特异性缺陷。

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数字

**图1。**
鼻腔接种100 PFU后，体内急性期复制不需要M2。（A） C57BL/6小鼠经鼻感染100个γHV68M2.Stop或γHV68M3.MR的PFU，并在6 dpi（d6）时提取左肺。显示的结果由两个独立的实验汇编而成，每个实验有三到五只小鼠。（B） C57BL/6小鼠经鼻感染100个γHV68M2.Stop或γHV68M3.MR的PFU，并在9dpi（d9）时提取左肺。显示的结果由两个独立的实验汇编而成，每个实验有三到五只小鼠。通过NIH 3T12单层上的菌斑试验测定肺部病毒滴度。每个点代表单个小鼠的病毒滴度。连续水平线表示斑块检测的检测水平（50 PFU），短水平线表示各组的平均病毒滴度。

**图2。**
纯化脾B淋巴细胞的FACS分析。按照材料和方法中的描述制备从C57BL/6小鼠中获取的脾细胞。通过用泛素B细胞标记物CD19（CD19-PE）的PE结合抗体和B220的FITC-结合抗体（B220-FITC）染色分离脾B细胞。显示了一个代表性实验的流式细胞仪点图。（A）用CD19-PE和B220-FITC对未分离的大体积脾细胞进行染色。CD19⁺B220型⁺wtγHV68、γHV68M2.Stop或γHV68M2.MR感染分别占总脾细胞群的40.66%±10.03%（平均值±平均值的标准误差）、49.45%±4.47%或42.26%±11.58%，无论感染途径或剂量和dpi如何。（B）分类后FACS分析表明分离的脾B淋巴细胞的纯度。CD19的纯度⁺B220型⁺11次以上重复实验为93.9%±0.76%。分类人群的污染程度限制在CD19的5.60%±1.85%⁻B220型⁻分数。

**图3。**
鼻腔接种100 PFU后，需要M2在脾脏中建立γHV68潜伏期。用100个γHV68M2.Stop、γHV68M3.MR或wtγHV68的PFU经鼻感染C57BL/6小鼠，16dpi（d16）时采集脾脏。脾B细胞（CD19⁺B220型⁺)如材料和方法（图2）所述，通过FACS纯化。通过限制稀释体外再激活试验和限制稀释病毒基因组PCR试验分析大量脾细胞和分离的B细胞。（A）未分类脾细胞激活病毒的频率。（B） FACS纯化的脾B细胞激活病毒的频率。（C）携带病毒基因组的未分类脾细胞的频率。（D）携带病毒基因组的FACS纯化脾B细胞的频率。对于限制稀释的体外再激活试验（A和B），在MEF指示单层上连续稀释活的完整脾细胞或B细胞，同时使用机械破坏的样品，以区分潜伏期再激活的病毒和预先形成的感染病毒。在本报告中，未检测到任何检测菌株的预先形成的传染性病毒；因此，为了清楚起见，未显示这些数据。对于每个样品稀释，对24个孔的CPE存在情况进行评分（见材料和方法）。限制稀释PCR分析用于确定携带病毒基因组（C和D）的大体积脾细胞或B细胞的频率。样品被连续稀释至10倍的背景⁴对未感染的细胞进行裂解，并进行巢式PCR检测病毒基因组（见材料和方法）。数据表示为病毒（CPE或病毒DNA）阳性微孔平均百分比的平均±标准误差。两种分析的曲线拟合线均来自非线性回归分析。水平线表示63.2%，根据泊松分布确定细胞激活病毒的频率或携带病毒基因组的细胞的频率。所示数据来自三个独立的实验。

**图4。**
鼻腔接种4×10后，需要M2才能从脾脏B细胞的潜伏期中重新激活γHV68⁵PFU。C57BL/6小鼠经鼻感染4×10⁵在16dpi（d16）时收获γHV68M2.Stop、γHV68M3.MR或wtγHV68的PFU和脾脏。脾B细胞（CD19⁺B220型⁺)如材料和方法（图2）所述，通过FACS纯化。通过限制稀释体外再激活试验和限制稀释病毒基因组PCR试验分析大量脾细胞和分离的B细胞。（A）未分类脾细胞激活病毒的频率。（B） FACS纯化的脾脏B细胞重新激活病毒的频率。（C）携带病毒基因组的未分类脾细胞的频率。（D）携带病毒基因组的FACS纯化脾B细胞的频率。图3图例和材料与方法中描述了限制稀释体外再激活试验（A和B）和限制稀释PCR试验（C和D）。数据表示为病毒（CPE或病毒DNA）阳性微孔平均百分比的平均±标准误差。两种分析的曲线拟合线均来自非线性回归分析。水平线表示63.2%，根据泊松分布确定细胞激活病毒的频率或携带病毒基因组的细胞的频率。显示的数据来自三个独立的实验。

**图5：。**
腹腔接种100 PFU后，需要M2才能从脾脏B细胞的潜伏期中重新激活γHV68。用100个PFU的γHV68M2.Stop、γHV68M3.MR或wtγHV68腹腔内感染C57BL/6小鼠，并在16dpi（d16）时采集脾脏。脾B细胞（CD19⁺B220型⁺)如材料和方法（图2）所述，通过FACS纯化。通过限制稀释体外再激活试验和限制稀释病毒基因组PCR试验分析大量脾细胞和分离的B细胞。（A）未分类脾细胞激活病毒的频率。（B） FACS纯化的脾B细胞激活病毒的频率。（C）携带病毒基因组的未分类脾细胞的频率。（D） FACS纯化的携带病毒基因组的脾脏B细胞的频率。图3图例和材料与方法中描述了限制稀释体外再激活试验（A和B）和限制稀释PCR试验（C和D）。数据表示为病毒（CPE或病毒DNA）阳性微孔平均百分比的平均±标准误差。两种分析的曲线拟合线均来自非线性回归分析。水平线表示63.2%，根据泊松分布确定细胞激活病毒的频率或携带病毒基因组的细胞的频率。所示数据来自三个独立的实验。

**图6。**
sIgD表面免疫球蛋白染色的FACS分析⁺和sIgD⁻脾B细胞群。在16、42、91或182 dpi时采集大量脾细胞，并用CD19和sIgD抗体染色。染色后，按照材料和方法中的描述对样品进行磁性细胞分离。显示了一个代表性实验的流式细胞仪点图。（A）脾细胞的分类前分析。在磁电池分离后，CD19⁺无论感染途径或dpi如何，γHV68M2停止感染后的人群约占脾细胞总数的93.64%±1.60%，γHV68 M2.MR感染后的人口约占91.66%±4.54%。此外，γHV68M2.Stop感染后，CD19⁺可溶性免疫球蛋白D⁺和CD19⁺sIgD公司⁻无论是感染途径还是dpi，磁分离后的亚群分别占脾细胞总数的84.69%±4.21%和8.95%±3.40%。γHV68M2.MR感染后，CD19⁺sIgD公司⁺和CD19⁺可溶性免疫球蛋白D⁻无论是感染途径还是dpi，磁分离后的亚群分别占脾细胞总数的84.64%±5.76%和7.03%±1.58%。（B和C）后分类分析表明分离的脾B细胞亚群的纯度。10个实验的平均纯度如下：对于γHV68M2。停止感染，CD19为98.05%±0.56%⁺sIgD公司⁺CD19为94.55%±2.33%⁺sIgD公司⁻（CD19污染3.09%±2.02%⁺sIgD公司⁺人口）；γHV68M2.MR感染，CD19为98.38%±0.53%⁺可溶性免疫球蛋白D⁺CD19为94.49%±3.41%⁺sIgD公司⁻（来自CD19的2.66%±1.85%污染⁺sIgD公司⁺人口）。

**图7。**
sIgD公司⁺脾脏B细胞在感染后后期携带M2突变病毒的频率增加。用100个γHV68M2.Stop或γHV68M3.MR的PFU腹腔内感染C57BL/6小鼠，并在16、42或182 dpi时采集脾脏（分别为d16、d42或d182）。未分类的脾细胞和FACS纯化的CD19⁺sIgD公司⁺和CD19⁺sIgD公司⁻如图3图例和材料与方法中所述，通过限制稀释的病毒基因组PCR分析对脾B细胞（图6和材料和方法）进行分析。CD19的（顶行）频率⁺sIgD公司⁺和CD19⁺sIgD公司⁻脾脏B细胞以16dpi的速度携带病毒基因组。（中排）未分类脾细胞和CD19的频率⁺sIgD公司⁺和CD19⁺sIgD公司⁻以42dpi携带病毒基因组的脾脏B细胞。（下一行）未分类脾细胞和CD19的频率⁺sIgD公司⁺和CD19⁺sIgD公司⁻脾脏B细胞携带182 dpi的病毒基因组。数据表示为病毒DNA阳性微孔平均百分比的平均±标准误差。通过非线性回归分析得出曲线拟合线。水平线表示63.2%，根据泊松分布确定携带病毒基因组的细胞的频率。所示数据来自两个或三个独立实验。rxns，反应。

**图8。**
经鼻低剂量接种后，感染后期脾脏B细胞中存在M2突变病毒。C57BL/6小鼠经鼻感染100个γHV68M2.Stop或γHV68M3.MR PFU，并在42或91 dpi（分别为d42或d91）时采集脾脏。脾B细胞（CD19⁺B220型⁺)如材料和方法中所述，在42 dpi（图2）和CD19下通过FACS纯化⁺sIgD公司⁺和CD19⁺sIgD公司⁻在感染后3个月纯化脾脏B细胞（图6）。如图3图例和材料与方法中所述，通过限制稀释的病毒基因组PCR检测分析大量脾细胞和分离的B细胞。（顶行）42 dpi时未分类脾细胞和FACS纯化的携带病毒基因组的脾B细胞的频率。（下一行）未分类脾细胞和CD19的频率⁺sIgD公司⁺和CD19⁺sIgD公司⁻感染后3个月时，含有病毒基因组的脾B细胞。数据表示为病毒DNA阳性微孔平均百分比的平均±标准误差。通过非线性回归分析得出曲线拟合线。水平线表示63.2%，根据泊松分布确定携带病毒基因组的细胞的频率。显示的数据来自两到三个独立的实验。rxns，反应。

**图9：。**
γHV68访问记忆B细胞的机制。正如已经提出的EBV、γHV68感染原始B细胞（CD19）⁺可溶性免疫球蛋白D⁺)可能导致病毒驱动的B细胞分化，从而在记忆B细胞中建立长期潜伏期（A）。或者，在某些实验条件下（例如，高剂量感染和/或通过腹腔接种进行的系统感染），通过抗原活化的原始B细胞（B）的γHV68感染和/或者生发中心或记忆B细胞（C）的直接感染，可能会发生对记忆B细胞库的被动访问。主动分割CD19⁺sIgD公司⁻生发中心B细胞在体外再激活试验中观察到的γHV68再激活中占很大比例（；Moser和Speck，未发表）。在体内，可能需要从GC B细胞中重新激活病毒，以重新接种潜伏的蓄水池。

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1. E.T.Clambey、H.W.T.Virgin和S.H.Speck。2002.小鼠γ-疱疹病毒68自发9.5千碱基缺失突变的特征分析揭示了潜伏期的组织特异性遗传需求。J.维罗尔。76:6532-6544.-项目管理咨询公司-公共医学
1. Doherty，P.C.、J.P.Christensen、G.T.Belz、P.G.Stevenson和M.Y.Sangster。2001.分析宿主对γ-疱疹病毒的反应。菲洛斯。事务处理。R.Soc.伦敦。乙356:581-593。-项目管理咨询公司-公共医学
1. Doherty，P.C.、R.A.Tripp、A.M.Hamilton-Eston、R.D.Cardin、D.L.Woodland和M.A.Blackman。1997.调节免疫失调：传染性单核细胞增多症的实验模型。货币。操作。免疫学。9:477-483.-公共医学
1. Efstathiou，S.、Y.M.Ho、S.Hall、C.J.Styles、S.D.Scott和U.A.Gompels。1990年。小鼠疱疹病毒68与γ-疱疹病毒Epstein-Barr病毒和疱疹病毒saimiri.J.Gen.Virol在基因上相关。71:1365-1372.-公共医学

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[6] Doherty，P.C.、J.P.Christensen、G.T.Belz、P.G.Stevenson和M.Y.Sangster。2001.分析宿主对γ-疱疹病毒的反应。菲洛斯。事务处理。R.Soc.伦敦。乙356:581-593。-项目管理咨询公司-公共医学

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[10] Efstathiou，S.、Y.M.Ho、S.Hall、C.J.Styles、S.D.Scott和U.A.Gompels。1990年。小鼠疱疹病毒68与γ-疱疹病毒Epstein-Barr病毒和疱疹病毒saimiri.J.Gen.Virol在基因上相关。71:1365-1372.-公共医学

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