Heterodimeric amino acid transporter glycoprotein domains determining functional subunit association

doi:10.1042/BJ20050021

.2005年6月1日；388（第2部分）：435-43。

doi:10.1042/BJ20050021。

异二聚体氨基酸转运蛋白糖蛋白结构域决定功能亚单位关联

法国拉斐拉¹, 埃米利亚·维尔伊科维奇, 史蒂芬·沃尔特, 卡斯滕·瓦格纳, 弗朗索瓦·维雷

附属公司

PMID： 15679469
PMCID公司：项目经理1138950
内政部： 10.1042/BJ20050021

异二聚体氨基酸转运蛋白糖蛋白结构域决定功能亚单位关联

法国拉斐拉等。生物化学杂志. 2005.

.2005年6月1日；388（第2部分）：435-43。

doi:10.1042/BJ20050021。

作者

法国拉斐拉¹, 埃米利亚·维尔伊科维奇, 史蒂芬·沃尔特, 卡斯滕·瓦格纳, 弗朗索瓦·维里

附属

¹苏黎世大学生理学研究所，瑞士苏黎世，CH-8057，Winterthurerstrasse 190。

PMID： 15679469
PMCID公司：项目经理1138950
内政部： 10.1042/BJ20050021

摘要

异聚氨基酸转运蛋白糖蛋白亚基rBAT和4F2hc（重链）与不同的催化亚基（轻链）形成由二硫键共价稳定的功能性异二聚体。rBAT与b（0，+）AT结合形成胱氨酸和阳离子氨基酸转运体缺陷，4F2hc与其他同源轻链结合，例如与LAT1结合形成系统L中性氨基酸转运器。为了在重链中识别与伙伴轻链识别和功能相互作用有关的结构域，在非洲爪蟾卵母细胞中与b（0，+）AT或LAT1共表达嵌合体和截断形式的rBAT和4F2hc。通过免疫共沉淀分析重链-轻链关联，并通过示踪吸收实验测试转运功能。结果表明，rBAT的胞质尾部和跨膜结构域在与b（0，+）AT的选择性功能相互作用中起主导作用，而rBAT胞外结构域似乎特别促进L-胱氨酸的摄取。对于4F2hc，即使没有胞外结构域，与LAT1的功能相互作用也由N末端部分介导，包括细胞质尾部、跨膜段和颈部。此外，4F2hc的胞外部分也支持与LAT1的功能关联，该胞外部分包含颈部和与rBAT互补部分相连的糖苷酶样结构域。总之，细胞质尾部和跨膜段共同对rBAT与b（0，+）AT的功能相互作用起决定作用，而细胞质或细胞外糖苷酶样结构域对于4F2hc与LAT1的功能相互作用是不必要的。

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数字

**图1。异二聚体氨基酸转运蛋白糖蛋白亚基（重链）结构示意图和总结结果**
衍生自4F2的结构域*hc公司*和rBAT分别表示为白色和实心矩形。总结表明，糖蛋白亚基的细胞内和跨膜结构域在决定与轻链亚基的功能结合的选择性方面起着关键作用。TM，跨膜结构域；免疫沉淀；nd，未确定；1、抗b抗体免疫沉淀^0,+AT 2，低表达水平/稳定性。

图2。rBAT的N-糖基化模式和嵌合体*B44B型*和*英国广播公司4*
与内切糖苷酶H（Endo-H）和N个-糖苷酶F（Endo-F）在表达rBAT或指示嵌合体的卵母细胞的裂解液中进行，这些卵母细胞被生物合成标记为L（左）-[³⁵S] 蛋氨酸。免疫沉淀采用抗rBAT抗体。hc，重链；B类^t吨，末端糖基化rBAT；B类^c（c），核心糖基化rBAT；B类^d日，脱糖基rBAT；4^t吨，末端糖基化4F2hc公司; 4^c（c），核心糖基化4F2hc公司; 4^d日，脱糖基4F2hc公司分子质量标记（kDa）显示在左侧（在本图和后续图中）。

**图3。轻链亚基b的共免疫沉淀和细胞表面表达^0,+AT和糖蛋白亚基结构**
卵母细胞注射有指示的cRNA(一,C类,D类)，新合成的蛋白质被生物合成标记为L（左）-[³⁵S] 蛋氨酸。(一,C类)使用针对rBAT N末端的抗体对生物合成标记材料进行免疫沉淀(B类)用轻链b抗体对细胞表面蛋白进行免疫印迹^0,+自动变速箱(D类)使用抗-b抗体免疫沉淀生物合成标记材料^0,+AT抗体。在指示的还原条件下进行SDS/PAGE（βME；=2-ME）。hc，重链；B类^t吨，rBAT末端糖基化；4^t吨，4F2hc公司末端糖基化；B类^c（c），rBAT核心糖基化；4^c（c），4F2hc公司核心糖基化；B、 rBAT；硬盘¹¹⁷，rBATΔ117和b的异二聚体^0,+自动变速器；B类¹¹⁷，rBATΔ117。

**图4。b条^0,+-内源性卵母细胞轻链重链构建物诱导的类转运活性**
卵母细胞注射10 ng每种cRNA，rBATΔ117除外(一)其中使用了30 ng。表达2-3天后，摄取（Na中10分钟⁺-自由溶液）(一)L（左）-[^三H] 精氨酸（100μM）或(B类)L（左）-[¹⁴C] 测定胱氨酸（50μM，在10 mM二胺存在下）。与L（左）-4F2诱导的精氨酸转运速率*hc公司*，由*英国广播公司4*和*BB4B型*经方差分析后测显著升高。对于L（左）-胱氨酸，所有嵌合体的摄取量与4F2相比无统计学差异*hc公司*根据方差分析后测试t吨测试分析为阳性*英国广播公司4*,*英国广播公司44*和*BB4B型*.

**图5。轻链亚基LAT1和糖蛋白亚基构建物的共免疫沉淀和细胞表面表达**
卵母细胞被注入指示的cRNAs和新合成的蛋白质生物合成标记L（左）-[³⁵S] 蛋氨酸。针对轻链LAT1的抗体用于免疫沉淀。(C类)细胞表面蛋白首先用生物素标记，通道2-4显示抗LAT1抗体的免疫沉淀。然后将该免疫沉淀提交链霉素沉淀，以选择细胞表面生物素化蛋白（5-8道）。在指示的还原条件下进行SDS/PAGE（βME；=2-ME）。hc，重链；硬盘^4F2层，异二聚体4F2hc公司-LAT1；B类^t吨，rBAT末端糖基化；4^t吨，4F2hc公司末端糖基化；B类^c（c），rBAT核心糖基化；4^c（c），4F2hc公司核心糖基化；硬盘¹¹⁷和hd¹³³LAT1和4F2的异二聚体*hc公司*Δ117或4F2hc公司Δ133。

**图6。与重链结构共同表达的LAT1的L型转运活性**
卵母细胞注射10 ng所示cRNA。表达1天后（截断4天后），摄入L（左）-[¹⁴C] 测量异亮氨酸（100μM）（10分钟，Na⁺-补充10 mM的自由缓冲液L（左）-精氨酸到b区^0,+AT）注入1 nmol未标记L（左）-苯丙氨酸反式-刺激。传输速率如实验部分所述。与L（左）-LAT1单独诱导的异亮氨酸转运速率*44B4个*根据ANOVA后验（Bonferroni），两种截断与LAT1均显著高于*444亿*和*英国广播公司44*达到了一个重要的水平t吨测试分析。

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