CHOP induces death by promoting protein synthesis and oxidation in the stressed endoplasmic reticulum

doi:10.1101/gad.1250704

比较研究

.2004年12月15日；18(24):3066-77.

doi:10.1101/gad.1250704。

CHOP通过促进应激内质网中的蛋白质合成和氧化诱导死亡

斯特凡·马西尼亚克¹, 池玉云, Seiichi Oyadomari公司, 伊莎贝尔·诺沃亚, 张玉红, Rivka Jungreis公司, 长田和弘, 希瑟·P·哈丁, 大卫·罗恩

附属公司

PMID： 15601821
预防性维修识别码： PMC535917型
内政部： 10.1101/gad.1250704

比较研究

CHOP通过促进应激内质网中的蛋白质合成和氧化诱导死亡

斯特凡·马西尼亚克等人。基因开发. 2004.

.2004年12月15日；18(24):3066-77.

doi:10.1101/gad.1250704。

作者

斯特凡·马西尼亚克¹, 池玉云, Seiichi Oyadomari公司, 伊莎贝尔·诺沃亚, 张玉红, Rivka Jungreis公司, 长田和弘, 希瑟·P·哈丁, 大卫·罗恩

附属

¹Skirball生物分子医学研究所，纽约大学医学院细胞生物学系，纽约，美国纽约10016。

PMID： 15601821
预防性维修识别码： PMC535917型
内政部： 10.1101/gad.1250704

摘要

未折叠和畸形的客户蛋白对内质网（ER）施加压力，导致病理生理条件下的细胞死亡。转录因子C/EBP同源蛋白（CHOP）被内质网应激激活，CHOP缺失可防止其致命后果。我们发现CHOP直接激活GADD34，GADD34通过去磷酸化应激细胞中翻译起始因子2（eIF2alpha）α亚单位的磷酸化-Ser 51促进ER客户端蛋白的生物合成。因此，GADD34表达受损可降低CHOP（-/-）细胞中暴露于损害ER功能的扰动的客户蛋白负荷和ER应激。CHOP（-/-）和GADD34突变细胞在其应激内质网中积累的高分子量蛋白复合物少于野生型细胞。此外，缺乏GADD34定向eIF2α去磷酸化的小鼠，如CHOP（-/-）小鼠，对内质网应激诱导药物衣霉素的肾毒性具有抵抗力。CHOP还激活编码ER氧化酶的ERO1alpha。因此，应激CHOP（-/-）细胞的ER是相对低氧化的。促进低氧化内质网的药理学和遗传操作可减少应激内质网中异常的高分子量蛋白质复合物，并防止内质网应激的致命后果。CHOP缺失通过减少内质网客户蛋白负荷和改变细胞器内的氧化还原条件来保护细胞免受内质网应激。

PubMed免责声明

数字

**图1。**
转录谱分析揭示了UPR和特异性基因缺陷的诱导速度减慢*CHOP公司^-/-*成纤维细胞。(A类)平均表达式的图形表示(n个=4）未经处理和衣霉素处理、野生型和*CHOP公司^-/-*MEF公司。每个竖线代表一个基因。绿色表示表达水平相对较低，红色表示特定mRNA的表达水平相对较高(B类)被衣霉素显著激活的206个基因簇在野生型或*CHOP公司^-/-*细胞。基因排列有序(左边到*正确的*)在8-h时，野生型样品中的衣霉素诱导率按降序排列。

**图2。**
衣霉素处理的内质网应激水平较低*CHOP公司^-/-*细胞。(A类)野生型和*CHOP公司^-/-*不同剂量的衣霉素处理细胞6h(B类)免疫印迹，如A类用0.5μg/mL衣霉素处理指定时间段的细胞数(顶部两个面板）和新合成的免疫沉淀的放射自显影[³⁵S] 脉冲标记处理细胞后的BiP(底部). (C类)自动射线照片³⁵S-标记的Hsp47免疫沉淀自野生型和*CHOP公司^-/-*细胞短暂脉冲[³⁵S] 蛋氨酸暴露于指定浓度的衣霉素1h后。在SDS-PAGE上显示了Hsp47的糖化（G）和非糖化（O）形式的位置。此外，还显示了抗Hsp47抗血清免疫沉淀的无关条带(^★) (天)衣霉素治疗一段时间后（0.5μg/mL），溴化乙锭染色凝胶，无片段和IRE1片段XBP-1 RT-PCR产品（报告mRNA）。两种基因型的每个样本中剪接/未剪接RNA的比率也以图形形式表示。

**图3。**
GADD34诱导受损*CHOP公司^-/-*细胞在应激过程中导致持续的eIF2α磷酸化。(A类)从衣霉素处理的野生型和*CHOP公司^-/-*细胞。(B类)野生型和*CHOP公司^-/-*细胞，暴露于2μg/mL衣霉素、400 nM thapsigargin、25μM亚砷酸盐或未经处理（UT）。(C类)染色质免疫沉淀*GADD34公司*使用来自未经处理和衣霉素处理（2μg/mL，8 h）野生型和*CHOP公司^-/-*通过针对GADD34启动子区域或外显子2的定量基因组PCR检测到的细胞。未经治疗的患者体内的信号*CHOP公司^-/-*细胞被任意赋值为1。

**图4。**
在内质网应激期间，客户蛋白合成的恢复增强使野生型细胞易于积累高分子量内质网蛋白复合物。(A类)通过蔗糖浮选分离的放射性标记微粒体蛋白凝胶的放射自显影和考马斯染色[³⁵S] 蛋氨酸脉冲标记野生型和*CHOP公司^-/-*用400 nM thapsigargin处理的MEFs。(B类)自动射线照相(顶部)和Grp94、BiP和PDI免疫印迹(底部)野生型6-h时间点的蛋白质A类然后通过10%-40%的甘油梯度进行速度梯度离心。(C类)未经处理和衣霉素处理（2μg/mL，8 h）野生型细胞的BiP免疫印迹。在每条通道中，总共装载5%的输入物、核后上清液（PNS）或从经指定浓度SDS处理并进行甘油梯度离心的核后上清中获得的颗粒。(天)通过甘油梯度从0.8%SDS处理的样品中提取的组分BiP的免疫印迹C类（请注意，BiP作为一个大的复合物在垫层中迁移形成一个明显的峰，该峰被一个透明带与低分子量材料隔开）。(E类)粒化BiP的免疫印迹（如天)以及来自未经处理和经衣霉素处理野生型的输入核后上清液（PNS）BiP的5%，*CHOP公司^-/-*和*加德34*突变细胞。

**图6。**
CHOP依赖性ERO1α诱导有利于异常氧化蛋白复合物。(A类)未经处理和衣霉素处理（2μg/mL，8 h）野生型和*CHOP公司^-/-*通过实时定量PCR测量细胞，并以ERO1αmRNA与βActin mRNA的比值表示(B类)染色质免疫沉淀*能源监管局1*α与未经处理和衣霉素处理的野生型抗CHOP抗血清和*CHOP公司^-/-*靶向启动子区的定量基因组PCR检测细胞*能源监管局1*α. 未经治疗的患者体内的信号*CHOP公司^-/-*细胞被任意赋值为1。(C类)未经处理和衣霉素处理野生型和*CHOP公司^-/-*细胞在体内用DTT激发，然后在无还原剂的情况下追逐指定的时间，然后在非还原缓冲液中溶解。将相同的样品加载到还原和非还原凝胶上。PDI的低迁移率还原型（RED）和高迁移率氧化型（OX）的位置显示在非还原性SDS-PAGE旁边。星号表示与PDI抗体反应的无特征不变带。(天)Hsp47和BiP在SDS-resistant HMW复合体（PELLET）和5%输入的野生型和*印章^-/-*用膜霉素（2μg/mL）处理指定时间的细胞。在异径管上加载相同的样品(左边)和非还原(*正确的*)SDS-PAGE电泳。指出了Hsp47二硫稳定络合物、糖基化（G）单体和非糖基化单体以及BiP的位置。(E类)通过含有100 mM DTT的20%甘油垫进行速度离心分离的未经处理和膜霉素处理（2μg/mL，8 h）野生型细胞的HMW复合颗粒（P）和上清液（S）中BiP的免疫印迹。(F类)在SDS-resistant HMW complex（PELLET）中对BiP和Hsp-47进行免疫印迹，并在体内用衣霉素（2μg/mL）和DTT指示浓度处理野生型细胞的5%输入核后上清液（PNS）8小时。

**图5。**
GADD34磷酸酶活性的丧失可保护肾上皮免受衣霉素的侵害。(A类)野生型显微照片（10×），*加德34*^{ΔC类/ΔC类}和*CHOP公司^-/-*注射1μg/g衣霉素96h后，小鼠肾脏用苏木精和伊红染色。(B类)相同截面的显微照片（100×和400×）。注意，在典型的野生型样本中，皮质-中胚层交界处存在广泛的肾小管间质损伤，突变体中没有这种损伤。(C类)96小时衣霉素处理野生型肾小管间质损伤的定量(n个=12只动物），*GADD34公司*^{ΔC类/ΔC类}(n个= 12),*CHOP公司^+/-*(n个=8），以及*CHOP公司^-/-*(n个= 8). 通过修改的Shih量表（Shih等人，1988年）和通过Mann-Whitney非参数检验计算的P值进行分级。(天)通过计算来自12个野生型和12个高倍视野（hpf）肾脏中的TUNEL阳性细胞来量化细胞死亡*GADD34公司*^{ΔC类/ΔC类}动物。给出了每只动物每个肾脏两个字段的平均值。每个基因型的平均值±SEM由横条表示，P值由双尾Student’s计算t吨-测试。(E类)野生型和*GADD34公司*^{ΔC类/ΔC类}肾脏TUNEL染色，Hoescht反染色。

**图7。**
击倒*ero-1型*在里面*秀丽线虫*对膜霉素的致命作用具有保护作用。在模拟RNAi上饲养的成年线虫存活曲线，*ero-1型*RNAi，以及*sel-1公司*RNAi，并在第0天用30μg/mL衣霉素治疗24小时(A类)模拟RNAi和*ero-1型*RNAi。所示为典型实验(n个= 3). (B类)模拟RNAi和*sel-1公司*RNAi。中的数据A类和B类来自同一个实验，为了清晰起见，用两张图表示。使用双因素方差分析确定曲线发散的P值。(C类)来自*热休克蛋白-4*::*绿色荧光粉*动物在指定的RNAi上生长后，用30μg/mL衣霉素治疗24小时。GFP信号反映了UPR报告者的活性，而抗HDEL抗体检测到一个50-kDa的不变带，用于这里的负载控制。

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