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。2005年1月；54(1):142-51.
doi:10.1136/gut.2004.042127。

人肝星状细胞系LX-1和LX-2：肝纤维化分析的新工具

L Xu先生 1, 阿Y Hui, E阿尔巴尼斯, M J亚瑟, S M O’Byrne先生, W S Blaner公司, P穆克吉, S·L·弗里德曼, F J工程师
附属公司

人肝星状细胞系LX-1和LX-2：肝纤维化分析的新工具

L Xu先生等人。 肠子。 2005年1月。

摘要

背景：肝星状细胞（HSC）是一种主要的纤维生成细胞类型，在慢性肝病期间有助于胶原蛋白积聚。随着人们对开发抗肝纤维化治疗方法的兴趣日益浓厚，有必要建立能够保存人肝干细胞体内表型的细胞系，以阐明人肝纤维化的途径。我们建立了两个名为LX-1和LX-2的人HSC细胞系并对其进行了表征，并将其特征与原代人星状细胞的特征进行了比较。

方法和结果：LX-1和LX-2是由SV40 T抗原永生化（LX-1）或低血清条件下的自发永生化产生的。免疫细胞化学显示，这两条线都表达α-平滑肌肌动蛋白、波形蛋白和胶质纤维酸性蛋白。与原发性HSC相似，这两种细胞系都表达调节肝纤维化的关键受体，包括血小板衍生生长因子受体β（betaPDGF-R）、肥胖受体长型（Ob-RL）和盘状结构域受体2（DDR2），以及参与基质重塑的蛋白质；西方分析测定的基质金属蛋白酶（MMP）-2、基质金属蛋白酶组织抑制剂（TIMP）-2和MT1-MMP。LX-2降低了TIMP-1的表达。LX-2（而非LX-1）在PDGF作用下增殖。这两种细胞系都表达α1（I）前胶原和HSP47的mRNA。转化生长因子β1刺激增加了α1（I）前胶原mRNA的表达，这由定量逆转录聚合酶链反应确定。LX-2，而不是LX-1，细胞是高度可转染的。这两个品系都具有典型的星状细胞的维甲酸表型。微阵列分析显示，原发性HSC与LX-1（98.4%）或LX-2（98.7%）的基因表达有很强的相似性，并且表达了多个神经元基因。

结论：LX-1和LX-2人HSC株为肝脏疾病的研究提供了有价值的新工具。这两条线路都保留了HSC的主要特征。LX-2的两个独特优势是其在无血清培养基中的活性和高转染性。

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数字

图1
图1
SV40大T抗原（TAg）在LX-1细胞系中的表达。对LX细胞进行免疫细胞化学分析（见方法）。SV40大T抗原在LX-1细胞的细胞核中检测到，但在LX-2细胞中没有检测到。细胞与DAPI共染色以识别细胞核。
图2
图2
通过LX-1和LX-2表达中间丝。对LX细胞进行免疫细胞化学分析（见方法）。LX-1和LX-2细胞均表达α-平滑肌肌动蛋白（α-SMA）、波形蛋白和胶质纤维酸性蛋白（GFAP），并形成细胞骨架网络。细胞与DAPI共染色以识别细胞核。
图3
图3
血小板衍生生长因子受体β（βPDGF-R）的表达和LX-2细胞对BB-PDGF的反应。（上图）免疫沉淀/西方分析（见方法）检测到LX-1和LX-2细胞中βPDGF-R亚单位的表达。以NIH3T3细胞和传代人肝星状细胞（HSC）为对照。（底部）BB-PDGF配体（1和10 ng/ml）在无血清培养基中刺激LX-2细胞增殖，根据三H-胸腺嘧啶掺入（cpm）。
图4
图4
通过西方分析检测受体和基质重塑蛋白的表达。对LX细胞系和原代肝星状细胞（HSC）的盘状结构域受体2（DDR2）和长型肥胖受体（Ob-R）的表达进行了比较L（左）)对于基质重塑蛋白MT1-MMP、基质金属蛋白酶组织抑制剂（TIMP）-2和TIMP-1（参见方法）：每个样品装载40μg细胞裂解物蛋白。
图5
图5
基质金属蛋白酶（MMP）-2蛋白的表达和活性。（上图）Western分析检测到原代肝星状细胞中MMP-2的前体和活性形式。在LX细胞中，主要检测到前MMP-2：每个样品中装载40μg来自细胞裂解物的蛋白质。（底部）LX-2细胞条件培养基的明胶酶谱显示分泌了前MMP2。
图6
图6
HSP47（A）和α1（I）前胶原（B）mRNA表达。采用定量实时逆转录聚合酶链反应（见方法）检测并比较原代肝星状细胞（HSC）、LX细胞、肝癌细胞Huh7和HepG2 HSP47（A）和α1（I）前胶原（B）mRNA的表达。原代HSC的表达水平被用作1的参考点，并显示了折叠差异。误差条代表平均值（SEM）（n = 3). 除LX-2细胞外，所有细胞均在Dulbecco改良Eagle’s培养基（DMEM）/10%胎牛血清（FBS）中培养，该培养基仅含1%胎牛血清。
图7
图7
转化生长因子β1（TGF-β1）增加肝星状细胞（HSC）（A）、LX-1（B）和LX-2（C）细胞中的α1（I）前胶原mRNA。通过定量实时逆转录聚合酶链反应（见方法）测量其对α1（I）前胶原mRNA水平的影响，检测原代HSC和LX细胞对TGF-β1的反应性。未经治疗的对照组被用作参考点，设定为1，显示TGF-β1治疗（2.5 ng/ml，持续20小时）后的折叠诱导。误差条代表平均值（SEM）（n=3).
图8
图8
LX-2细胞的转染效率。将六孔培养皿中80%融合的LX-2细胞转染Fugene和2.5μg表达增强型绿色荧光蛋白的质粒pEGFP-C2（Clontech）。（A） 转染LX-2细胞的明亮视野图像。（B） 同一区域细胞的荧光图像。
图9
图9
LX-1和LX-2细胞积累并酯化视黄醇。向LX-1（A）和LX-2（B）细胞培养基中添加0（对照）、2或10μM视黄醇24小时。然后用冰冷的磷酸盐缓冲盐水清洗细胞并收获。如方法部分所述，通过高压液相色谱法测量细胞中视黄醇和视黄醇酯的水平。
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