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.2004年11月9日；101(45):15927-32.
doi:10.1073/pnas.0407043101。 Epub 2004年10月27日。

OPA1需要线粒体融合蛋白1来促进线粒体融合

萨拉·西波拉特 1, 奥尔加·马丁斯·德布里托, 芭芭拉·达尔·齐利奥, 卢卡·斯科拉诺
附属公司

OPA1需要线粒体融合蛋白1来促进线粒体融合

萨拉·西波拉特等人。 美国国家科学院院刊. .

摘要

线粒体融合和分裂之间的调节平衡对于维持细胞器的完整性至关重要。线粒体融合机制在哺乳动物细胞中基本没有特征。目前尚不清楚OPA1（常染色体显性视神经萎缩中突变的内膜动力相关蛋白）是否参与融合或分裂。OPA1促进了细长线粒体分支网络的形成，需要GTPase和C末端线圈结构域的完整性。RNA干扰使OPA1水平稳定降低，导致线粒体较小、碎片化和分散。OPA1水平不影响线粒体对接，但与聚乙二醇线粒体融合试验测定的融合程度相关。遗传分析证明，OPA1不能通过缺乏外膜丝裂原融合蛋白1而不是丝裂原2的线粒体进行微管化和融合。我们的数据表明，OPA1在功能上需要丝裂原融合蛋白1来调节线粒体融合，并揭示了丝裂原1和2之间的特定功能差异。

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数字

图1。
图1。
OPA1的过度表达促进线粒体伸长。(A类–H（H）)GTPase和线圈结构域突变的影响。显示了转染线粒体形成蛋白的MEF中的线粒体形状。在盖玻片上生长的WT MEF与mtCFP和空载体共转染(A类)，WT OPA1(B类)，K301A OPA1(C类)，R905停止OPA1(D类)，Mfn1(E类)，Mfn2(F类)，WT DRP1(G公司)或K38A DRP1(H（H）). 24小时后，从随机选择的细胞中采集mtCFP荧光图像，进行反褶积并存储。（比例尺，15μm）(我)线粒体伸长的形态分析。将生长在盖玻片上的WT MEFs与mtCFP和空载体或指示的线粒体形成蛋白共转染。24小时后，采集、反褶积、存储20个随机选择的mtCFP荧光图像，然后按照支持材料和方法数据表示14个不同实验的平均值±SE。(J型–M（M）)MEF线粒体网络的三维立体重建。盖玻片上生长的MEF与mtYFP和空载体共转染(J型)或OPA1(L（左）)，24小时后，随机选择共焦z（z）-获取、存储、重建mtYFP荧光的轴堆栈，并按支持材料和方法.K（K）和M（M）表示装箱区域的3倍放大倍数J型和L（左）分别是。堆叠深度为20μm。（比例尺，15μm）
图2。
图2。
线粒体形状、线粒体融合和RNAi对抗OPA1后对丝裂原融合蛋白的反应。(A类)MEF克隆中OPA1的表达水平。电池（5×106)从携带pSilencer-control的克隆H4和携带pSillecer-OPA1的克隆A7中进行裂解，分离等量的蛋白质，并用抗OPA1（1:2000）抗血清和抗肌动蛋白单克隆抗体（1:2000，Chemicon）进行免疫印迹。(B类)OPA1消融后线粒体形态和对丝裂原融合蛋白的反应。从盖玻片上生长的克隆H4和A7的MEF转染mtCFP或与指定的丝裂原融合蛋白共转染。24小时后，如图1所示获得mtCFP荧光图像A类–H（H）（比例尺，15μm）(C类)形态分析。如图所示，转染盖玻片上生长的H4和A7 MEF。实验完全按照图1所示进行我数据表示四个不同实验的平均值±SE。(D类)来自H4和A7克隆的代表性异多核体。将来自所示克隆的MEF用mtYFP或mtRFP转染，共包被在玻璃盖玻片上，如实验程序，4小时后固定。显示了代表性多核体的共焦图像。（比例尺，20μm）(E类)定量OPA1消融对线粒体PEG融合分析的影响。实验按照中所述进行D类，但细胞在指定时间固定。线粒体融合评估如实验程序从30个随机选择的多核体中。数据表示三个不同实验的平均值±SE。
图3。
图3。
OPA1通过促进MFN1依赖的线粒体融合改变线粒体网的形状。(A类)OPA1对WT线粒体网络形态的影响，Mfn1公司–/–，和Mfn2公司–/–MEF。将生长在盖玻片上的指示基因型的MEF与mtCFP和空载体共转染(左侧)或OPA1(赖特). 当指示时，MFN1或MFN2与mtCFP在Mfn1公司–/–MEF。24小时后，如图1所示获得mtCFP荧光图像A类–H（H）(B类)WT的形态分析，Mfn1公司–/–，和Mfn2公司–/–线粒体。在盖玻片上生长的所示基因型的MEF与mtCFP和空载体（黑色条）或OPA1（灰色条）共同转染。如有指示，Mfn1公司–/–通过与MFN1或MFN2共转染来补充细胞。实验完全按照图1所示进行我数据表示九个不同实验的平均值±SE。(C类)用mtYFP或mtRFP转染指定基因型的MEF(左侧)或与mtYFP或mtRFP加OPA1联合转染(赖特)，镀铜在玻璃盖玻片上，与PEG熔融，如实验程序，4小时后固定。显示了代表性多核体的共焦图像。（比例尺，20μm）(D类)OPA1对WT融合影响的量化，Mfn1公司–/–，和Mfn2公司–/–线粒体。实验按照C类，但异多核体在指定时间固定。在用钻石描绘的实验中，Mfn1–/–细胞与mtYFP或mtRFP+MFN1（⋄）以及mtYFP-或mtRFP+MFN1和OPA1共同转染(♦）。线粒体融合评估如实验程序从30个随机选择的多核体中。数据表示四个不同实验的平均值±SE。
图4。
图4。
MFN1缺乏不会影响线粒体并列，但会阻止OPA1诱导的线粒体微管化。重量(A类),Mfn1公司–/– (B类)，以及Mfn2公司–/– (C类)MEF与mtYFP和空载体共转染(上部)或与mtYFP和OPA1一起使用(下部)，24小时后，共焦z（z）-按中所述获取堆栈支持材料和方法重建堆积物并重新定容，追踪单个线粒体的运动。单个的五倍放大部分z（z）-显示了与所示帧对应的平面。为了清晰起见，线粒体被分别标记为不同的颜色。箭头表示线粒体接触部位。管状线粒体的颜色是由其来源的单个线粒体的颜色合并而成的。（比例尺，4μm）
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