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.2004年12月；15(12):5208-18.
doi:10.1091/mbc.e04-07-0589。 Epub 2004年9月29日。

脊椎动物SUMO Paralogue的独特体内动力学

费尔汉·阿耶丁 1, 玛丽·达索
附属公司

脊椎动物SUMO旁系的独特体内动力学

费尔汉·阿耶丁等。 分子生物学细胞. 2004年12月.

摘要

哺乳动物中有三种SUMO同源物：SUMO-1与SUMO-2和SUMO-3的同源性约为45%，两者的同源性为96%。目前尚不清楚SUMO-1、-2和-3是否以独特、冗余或拮抗的方式发挥作用。为了解决这个问题，我们使用稳定表达每个与黄色荧光蛋白（YFP）融合的哺乳动物SUMO蛋白的细胞系来检测单个SUMO副产物的动力学。SUMO-2和-3在整个核质中的分布非常相似，而SUMO-1在核膜和核仁中的分布是唯一的。光漂白实验表明，SUMO-1动力学比SUMO-2和-3动力学慢得多。此外，SUMO副logue的迁移率在亚核结构之间存在差异。最后，随着细胞从有丝分裂中退出，旁系之间的时间和分布是不同的。SUMO-1在后期随着核膜的重组被募集到核膜上，并迅速积累到细胞核中。SUMO-2和SUMO-3较早定位于染色体，并在末期逐渐积累。总之，这些发现表明，哺乳动物SUMO-1在整个细胞周期中的利用模式与SUMO-2和-3的模式明显不同，说明其在体内具有独特的功能和特异性调节。

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图3。
图3。
YFP-SUMO对压力的反应。（A） YFP-SUMO-2和YFP-SSUMO-3与热应力的结合增强，但YFP-SUMO-1没有。对热应激（43℃；10 min）或对照（37℃；10分钟）表达YFP-SUMO的（全长）细胞株进行Western分析，表明YFP-SSUMO-2和YFP-SUSO-3结合优先上调。用GFP抗体（顶部）和肌动蛋白抗体作为负荷/印迹对照（底部）对Blot进行检测。（B） 作为2O（运行）三YFP-SUMO-1信号在活细胞PML体的处理和增加。在As作用前（0 h）和3.5 h后，在细胞中成像YFP-SUMO-12O（运行）三治疗。注意处理后细胞核内PML核体的数量和强度增加。图像显示为右侧所示的发光强度编码调色板。棒材，10μm。
图8。
图8。
有丝分裂期间YFP-SUMO嵌合体的时间推移成像。在细胞膜收缩后期（指定为0分钟）开始后，每隔3分钟记录一次转基因细胞的有丝分裂。在激光扫描时拍摄单个中期照片，以避免产生伪影或信号漂白。中期照片的右上角显示了胞质分裂开始前的捕获时间。A和C的插图显示固定的中期细胞，也用DNA染料DAPI染色。YFP-SUMO-1（A）与YFP-SSUMO-2（C）和SUMO-3（E）不同，纺锤信号增强，核周富集明显。不可结合YFP标记的SUMO1（G）在中期和后期仅在染色体区域排除扩散的细胞质信号。B、 D、F和H显示有丝分裂细胞相应的DIC图片。棒材，10μm。
图1。
图1。
YFP-SUMO融合蛋白在HeLa细胞中的表达。（A） YFP-SUMO的表达水平。对表达全长和不可结合（单甘氨酸）形式SUMO-1、SUMO-2和SUMO-3的YFP结合物的细胞进行Western分析。用GFP抗体（左）、抗人SUMO-1抗体（中）或SUMO-2/3抗体（右）检测相同的印迹。星号表示YFP-SUMO-1–共轭Ran-GAP1；箭头表示YFP-SUMO-1、YFP-SSUMO-2和YFP-SUSO-3的全长和不可共轭形式的位置（左）。车道如面板底部所示。字母“G”代表各YFP结合SUMO细胞系的单一甘氨酸（不可结合）版本。最后一条车道是未改造的HeLa母线。分子量标记（从上到下）为210、134、82、41、32和18kDa。（B） YFP-SUMO表达不会改变有丝分裂指数。对照HeLa细胞和表达YFP-SUMO结合物的细胞的有丝分裂指数频率。通过使用活细胞的相差显微镜分析，在一式三份的实验中对每个细胞系的500多个细胞进行评分。
图2。
图2。
YFP-SUMO嵌合体在间期细胞中的分布。（A） YFP-SUMO在活细胞中的分布。将稳定的转基因细胞系培养在盖底培养箱中，并观察到活细胞的间期定位模式：（a）YFP-SUMO-1，（b）YFP_SUMO-2，（c）YFPS-SUMO-3，（d）YFP-SUMO-1G，（e）YFP.SUMO-2G，（f）YFP/SUMO-3G，和（g）YFP。d–f中的箭头表示不可结合SUMO转基因细胞核质处的PML体样信号。荧光图像（左）与相应的DIC图像（右）配对，显示细胞核和核仁的位置。（B） 所有SUMO旁系都定位于PML机构。甲醛固定的YFP融合蛋白（绿色）与免疫定位的内源性PML蛋白（红色）的Colocalization。S1、S2和S3分别代表YFP结合的SUMO-1、SUMO-2和SUMO-3。DNA用DAPI（蓝色）染色，最后一列显示合并图像。（C） YFP-SUMO-1和RanGAP1在固定细胞中的分布。用免疫定位内源性RanGAP1（红色）对甲醛固定的YFP-SUMO-1（绿色）进行Colocalization。DNA用DAPI（蓝色）染色，最后一列显示合并图像。棒材，10μm。
图4。
图4。
YFP-SUMO嵌合体的FRAP分析。如图所示，在转基因细胞系的细胞核或核仁内有一个半径为2μm的圆点（点）被漂白，并且在漂白区域记录到荧光恢复（参见材料和方法). YFP-SUMO-1（A）的回收率低于YFP-SUMO-2（B）和YFP-SSUO-3（C）。YFP-SUMO-1的核仁FRAP分析如E所示。核仁所在区域的亮场图片（虚线方框）如E的插图所示。D显示Histone2B-YFP FRAP作为对照实验。棒材，10μm。
图5。
图5。
YFP-SUMO嵌合体的FRAP分析。每个细胞系五个单个细胞的平均回收曲线和标准偏差如A至D所示。半回收时间和标准偏差以E表示。
图6。
图6。
YFP-SUMO嵌合体的FLIP分析。在表达YFP-SUMO-1（A）、YFP-SUSMO-2（B）或YFP-SSUMO-3（C）的转基因细胞的细胞核或核仁内，有一个半径为2-μm的圆点（黑线材料和方法). 对不可结合的YFP-SUMO-1G-（D）、YFP-SSUM-2G-（E）或YFP-SUMO-3G（F）表达细胞以及单独表达YFP（G）或组蛋白2B-YFP的细胞进行了类似的实验。YFP-SUMO-1的核仁FLIP如I所示。核仁所在区域的亮场图片（虚线方框）如I.Bar中的插图所示，10μm。
图7。
图7。
YFP-SUMO嵌合体的FLIP分析。每行五个单个细胞的平均耗竭曲线及其标准偏差如A和B所示。半耗竭持续时间以C表示，并带有标准偏差。
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参考文献

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